實(shí)驗(yàn)九 PCR 擴(kuò)增DNA

1、教案首頁第_9_次課 授課時(shí)間：2006年12月26日12月30日課程名稱生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課年級2005專業(yè)、層次臨床醫(yī)學(xué)本科授課教師符偉玉職稱講師課 型(大、小)小學(xué)時(shí)4授課題目（章、節(jié)）實(shí)驗(yàn)九 PCR 擴(kuò)增DNA基本教材或主要參考書自編 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教學(xué)目的與要求：1、復(fù)習(xí)PCR的原理。2、掌握PCR及電泳操作技術(shù)。大體內(nèi)容與時(shí)間安排，教學(xué)方法：小結(jié)：質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化、制備、限制性內(nèi)切酶酶分析的實(shí)驗(yàn)，及實(shí)驗(yàn)報(bào)告存在的問題 5min1、PCR擴(kuò)增目的DNA的原理 15min2、PCR擴(kuò)增目的DNA操作步驟的改動 5min3、PCR擴(kuò)增目的DNA的注意事項(xiàng) 5min4、

2、學(xué)生做實(shí)驗(yàn) 130min教學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)+示教教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：重點(diǎn)：1、PCR擴(kuò)增目的DNA的原理2、PCR擴(kuò)增目的DNA的注意事項(xiàng)難點(diǎn)：PCR擴(kuò)增目的DNA的原理教研室審閱意見：教研室主任簽名：年 月 日基本內(nèi)容輔助手段和時(shí)間分配一、實(shí)驗(yàn)原理PCR：是一種選擇性擴(kuò)增DNA或RNA的方法，其基本原理是依據(jù)體內(nèi)細(xì)胞分裂中的DNA半保留復(fù)制機(jī)理，以及在體外dNTP分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈DNA；單鏈DNA與人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高溫的DNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNA。PCR反應(yīng)分3步：變性

3、：通過加熱使DNA 雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA；退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)，由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜得多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補(bǔ)的機(jī)會較少。延伸：在DNA聚合酶和4 種dNTP底物及Mg2+存在的條件下，5'3'的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)，以上3步為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，數(shù)小時(shí)之后，介于兩個(gè)引物之間的特異性DNA片段得到了大量復(fù)制，數(shù)量可達(dá)2×1067拷貝。蛋白激酶CK2是一種真核細(xì)胞中普遍存在的信使非依賴性絲/蘇氨酸蛋白激

4、酶。它是由兩個(gè)催化亞基(或')和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基()構(gòu)成的不均一四聚體。通過RT-PCR可從人的腫瘤細(xì)胞中擴(kuò)增出人的CK2亞基cDNA，通過與pT7-7載體定向克隆并經(jīng)測序確證得重組人蛋白激酶CK2亞基cDNA質(zhì)粒（pTCKB，3087 bp）。本實(shí)驗(yàn)利用此重組質(zhì)粒pTCKB作為DNA的擴(kuò)增模板，加入人蛋白激酶CK2亞基cDNA的上游和下游引物和4種dNTP底物，在Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。理論上擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小為672bp。上游引物：5' AATCTAGACATATGAGCAGCTCAGAGGAGGT 3'，其序列含人蛋白激酶CK2亞基cDNA編碼區(qū)起始的2

5、0個(gè)核苷酸。下游引物：5' AAGGATCCAAGCTTCAGCGAATCGTCTTGACTGG 3'，與人蛋白激酶CK2亞基cDNA編碼區(qū)最后21個(gè)核苷酸互補(bǔ)。二、操作步驟（改動）三、注意事項(xiàng)1、PCR反應(yīng)體系中DNA樣品及各種試劑的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量的準(zhǔn)確性及全部放入反應(yīng)體系中。2、為避免污染凡是用在PCR反應(yīng)中的Tip尖、離心管、蒸餾水都要滅菌；吸每種試劑時(shí)都要換新的滅菌Tip尖。3、加試劑時(shí)先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。4、加樣過程中所有試劑用完后均應(yīng)置于冰上。5、置PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)前，PCR管要蓋緊，否則使液體蒸發(fā)影響PCR

6、反應(yīng)。10min示意圖簡圖5min5min實(shí)驗(yàn)+示教130min 小 結(jié)PCR即聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它是近年來發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異性DNA 擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)實(shí)際上是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸(dNTP)存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA 結(jié)合的特異性。PCR技術(shù)為在重組DNA過程中獲得目的基因片段提供了簡便快速的方法，該技術(shù)可用于：與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接從組織和細(xì)胞的mRNA獲得目的基因片段；利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段；利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有一定序列相似性的基因片段；利用隨機(jī)引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。 基因的體外突變 在PCR技術(shù)建立以前，在體外對基因進(jìn)行各種突變是一費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作?，F(xiàn)在，利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。 PCR技術(shù)高度敏感，對模板DNA的含量要求很低，是DNA和RNA（RNA需要先反轉(zhuǎn)錄成為cDNA）微量分析的最好方法。理論上講，只要存在一分子的模板，就可以獲得目的片段。實(shí)際工