丹參對(duì)凍融小鼠卵巢同種異體移植后卵泡存活率的影響及其作用機(jī)制

1、丹參對(duì)凍融小鼠卵巢同種異體移植后卵泡存活率的影響及其作用機(jī)制        【摘要】     目的 ：探討丹參注射液對(duì)凍融小鼠卵巢同種異體移植缺血低氧損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法：收集B6C2F1第1天新生(D1)小鼠卵巢，慢凍速融后移植至B6C2F1代812周雄鼠的腎被膜下，移植后小鼠按給藥不同分為對(duì)照組和丹參組，分別于移植后1 d（24 h）、2 d(48 h)和14 d回收移植物，進(jìn)行超氧化物歧化酶（SOD）及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的RT-PCR半定

2、量測(cè)定，同時(shí)移植后14 d回收移植物做HE染色全卵巢卵泡計(jì)數(shù)及PCNA免疫組化分析。結(jié)果：移植后各時(shí)間段卵巢組織SOD mRNA的表達(dá)，丹參組均高于對(duì)照組，而iNOS mRNA的表達(dá)則均低于對(duì)照組。移植后14 d回收全卵巢總卵泡數(shù)，丹參組（2 709±234）多于對(duì)照組（1 889±202），P0.05；卵泡存活率，丹參組（64.1%）顯著高于對(duì)照組（44.7%），P0.05。結(jié)論 ：丹參注射液可能通過上調(diào)SOD mRNA的表達(dá)，抑制iNOS mRNA的表達(dá)而改善凍融小鼠卵巢同種異體移植缺血低氧性損傷，從而提高卵泡的存活率。     

3、【關(guān)鍵詞】  丹參；卵巢；冷凍保存；移植    Effects of danshen injection on the survival rates of follicle in heterotopically grafted newborn mouse ovaries and the relative mechanism  LIN Hai-yan， XIONG Cheng-rong， ZHU Qin， WU Dan-dan，TANG Fei，ZHOU Ying.  Department of Reproduction Ce

4、nter，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou，325000    Abstract:  Objective: To explore the protective effects of danshen injection on ischemia injury in heterotopically grafted newborn mouse ovaries. Methods:Ovaries from B6C2F1 newborn mice were cryopre

5、servation and the thawed ovaries were transplantated into kidney capsules of 812 w adult male mice.The mice were divided into two groups:control group and danshen group.The recipient mice were sacrificed on 1 d，2 d and 14 d respectively after transplantation. The grafts from 1 d， 2 d and 14 d were r

6、emoved to assess the mRNA expressions of SOD and iNOS with RT-PCR. Meanwhile，the grafts from 14 d were processed histologically for follicle counting and immunohistochemically for PCNA. Results: SOD-mRNA expression of ovarian tissue in the duration period after transplantation were higher than that

7、of danshen group， and the iNOS-mRNA expression were lower than that of control group. Number of follicles in 2 week old grafts after transplan-tation of danshen group （2 709±234） was more than that of control group （1 889±202）.There was an significant improvement in survival rate from 44.7

8、% to 64.1% if host animals were to be administered with danshen injection. Conclusion: Danshen injection may improved the survival rate of ovaries by reducing ischeamia injury in heterotopically grafted newborn mouse ovaries with the increase of SOD-mRNA expression and the decrease of iNOS-mRNA expr

9、ession.    Key words:  danshen；ovary；cryopreservation；transplantation    半個(gè)世紀(jì)以來的研究表明，卵巢組織的冷凍保存和卵巢移植是目前保留癌癥患者生育能力的較好方法1。移植后缺血低氧損傷導(dǎo)致的大量卵泡丟失仍然是阻礙移植卵巢組織功能恢復(fù)的關(guān)鍵問題2，其機(jī)制可能是移植物中脂質(zhì)過氧化和其他氧自由基所造成的缺血低氧損傷3。丹參是一種常用的活血化瘀中藥，它能清除自由基、改善血流變化和微循環(huán)狀態(tài)。許多研究表明，丹參對(duì)心、肝、肺等多種組織器官的缺血損傷具有明顯的改善作用

10、，但對(duì)于凍融卵巢組織移植過程中缺血低氧導(dǎo)致卵泡損傷的保護(hù)作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察丹參注射液對(duì)凍融小鼠卵巢移植早期缺血低氧卵泡損傷的保護(hù)作用及相關(guān)基因超氧化物歧化酶（SOD）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)影響，探討丹參的外源性保護(hù)作用及其與移植物低氧相關(guān)基因表達(dá)之間的關(guān)系。為進(jìn)一步探討如何降低凍融卵巢組織移植早期缺血低氧損傷機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。    1  材料和方法    1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為C57BL/6j雌鼠和BALB/c雄鼠，小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院國(guó)家嚙齒動(dòng)物研究中心上海分中心上海斯

11、萊克斯有限公司。供體為810周齡C57BL/6j雌鼠和1012周齡BALB/c雄鼠雜交的F1代第1天小鼠卵巢，受體為F1代812周雄鼠。    1.2  主要試劑與設(shè)備  丹參注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)Z33020177）；Leibovitz-15、胎牛血清、DMSO（Sigma公司）；兔抗增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司 ）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）；KRYO10-22series程序冷凍儀(英國(guó)Planer公司)；ThemoHybaid PCR儀(英國(guó)TECHNE公司)。

12、    1.3  實(shí)驗(yàn)方法    1.4  觀察指標(biāo)與方法    1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法  卵泡計(jì)數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩組間SOD mRNA和iNOS mRNA基因表達(dá)采用兩樣本的t檢驗(yàn)分析。    2  結(jié)果    2.1  全卵巢卵泡計(jì)數(shù)  移植后14 d新鮮卵巢組(見圖1a)中原始卵泡成簇排列，明顯多于對(duì)照組（見圖1b）和丹參組（見圖1c）。移植后14 d回收全

13、卵巢卵泡計(jì)數(shù)丹參組多于對(duì)照組，且原始卵泡、初級(jí)卵泡、竇前卵泡及竇卵泡各級(jí)卵泡數(shù)均多于對(duì)照組，差異存在顯著性（P <0.05）。卵泡存活率丹參組（64.1%）顯著高于對(duì)照組（44.7%），兩移植組均比移植后14 d新鮮組卵泡數(shù)顯著減少。詳見表2。    2.2  PCNA免疫組化結(jié)果  陽(yáng)性呈棕褐色，定位于初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞和卵細(xì)胞核內(nèi)，陰性細(xì)胞核呈藍(lán)色。對(duì)照組陽(yáng)性率為85%90%，丹參組為80%85%，兩組差異無顯著性。見圖2。    2.3  SOD mRNA和iNOS mRNA的基因表

14、達(dá)  SOD mRNA的表達(dá)在移植后的三個(gè)時(shí)間段，丹參組均明顯高于對(duì)照組（P<0.01），卵巢移植后的各時(shí)間段均有iNOS mRNA的表達(dá)，在對(duì)照組中，第1天iNOS mRNA開始升高，第2天達(dá)到最高值，第14天有所下降，與對(duì)照組相比，丹參組的iNOS表達(dá)降低，兩組差異存在顯著性（P<0.05），見表3、圖3。    3  討論    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，凍融新生小鼠卵巢異體移植能存活，且原始卵泡能生長(zhǎng)發(fā)育至各級(jí)卵泡。 PCNA 又稱周期素，與細(xì)胞增殖和DNA合成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)PCNA陽(yáng)性表達(dá)與Oktay等4

15、研究結(jié)果相一致，見于初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡及竇卵泡的顆粒細(xì)胞及初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞，原始卵泡未見PCNA的表達(dá)。兩組移植后14 d的卵巢組織PCNA的陽(yáng)性表達(dá)均較高，說明移植的卵巢組織均處于良好的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，但移植后14 d回收的兩組移植卵巢總卵泡數(shù)明顯少于移植后14 d新鮮小鼠卵巢的總卵泡數(shù)，進(jìn)一步證實(shí)了卵巢組織移植過程中由于無直接血管吻合導(dǎo)致的缺血低氧會(huì)損失很大一部分的卵泡4-5。本實(shí)驗(yàn)中我們把凍融小鼠卵巢移植至受體小鼠具有豐富血管的腎被膜下，但移植卵巢需要在其周圍重新形成血管網(wǎng)才能恢復(fù)血供，在移植后至血管形成期間卵巢組織由于缺血低氧將導(dǎo)致卵泡的大量丟失，其機(jī)制可能與活性氧ROS的釋放有關(guān)3。

16、許多領(lǐng)域的研究已經(jīng)證實(shí)ROS清除劑（如SOD、抗氧化劑維生素C、維生素E等）可以抑制ROS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。丹參中所含主要活性成分丹參酚等酚類，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可作為天然的抗氧化劑，因此我們將其應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示丹參組移植后14 d回收卵巢總卵泡數(shù)多于對(duì)照組，各級(jí)卵泡數(shù)也存在明顯差異，且丹參組的卵泡存活率達(dá)64.1%，顯著高于對(duì)照組的卵泡存活率的44.7%，說明丹參能減輕凍融卵巢移植后的缺血低氧損傷，提高卵泡存活率。    SOD是一類金屬酶，廣泛存在于不需氧的生物組織中， 它能催化超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過氧化氫和氧，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD

17、活力的高低間接反映了機(jī)體消除氧自由基的能力。丹參是一種強(qiáng)抗氧化劑，它的保護(hù)作用可能是抑制自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損害作用，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。王宇等6在大鼠肝的冷凍灌注保存液中加入丹參注射液，然后進(jìn)行大鼠原位肝移植，發(fā)現(xiàn)丹參組肝組織中的SOD活性明顯升高，肝組織缺血再灌注程度減輕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示丹參組各時(shí)間段移植卵巢組織中的SOD mRNA的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，說明了丹參注射液可能通過增高移植卵巢組織中SOD活性，清除氧自由基，對(duì)防治凍融卵巢移植后的缺血低氧損傷起到積極的作用。    NO和NOS與缺血再灌注損傷的關(guān)系密切。NO是一種半衰期很短的自由基氣體，

18、低濃度的NO對(duì)組織具有保護(hù)作用，而高濃度狀態(tài)下對(duì)組織有損害作用。NO是由NOS催化生成的，NOS分為三型：nNOS（神經(jīng)型）、eNOS（內(nèi)皮型）和iNOS（誘導(dǎo)型），前兩者的激活均依賴于鈣離子和鈣調(diào)蛋白的作用；iNOS在基態(tài)下不表達(dá)，可由炎癥因子、內(nèi)毒素等誘導(dǎo)激活，作用時(shí)間長(zhǎng)，可催化生成大量NO7。Matsumi等發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)不成熟的大鼠卵泡顆粒細(xì)胞中存在iNOS。聶瑩雪等8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，iNOS在缺血l2 h時(shí)開始增加， 隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)也逐漸增加。張瑩等9將丹參注射液注射至重癥胰腺炎大鼠模型體內(nèi)來觀察iNOS基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參早期治療能抑制iNOS表達(dá)從而起到保護(hù)胰腺的作用。

19、本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)在卵巢移植后的各時(shí)間段均有iNOS mRNA的表達(dá)，在對(duì)照組中，第1天 iNOS開始升高，第2天達(dá)到最高值，第14天有所下降，說明iNOS參與了卵巢移植后缺血損傷的過程。與對(duì)照組相比，丹參組的iNOS表達(dá)降低，兩組差異存在顯著性，提示丹參注射液可能通過下調(diào)iNOS mRNA的表達(dá)從而抑制NO的過度產(chǎn)生，對(duì)卵巢移植后的缺血-再灌注損傷起保護(hù)作用。    綜上所述，凍融新生小鼠卵巢同種異體移植原始卵泡能存活并生長(zhǎng)發(fā)育至各級(jí)卵泡，但移植早期的缺血低氧造成大量卵泡的丟失。丹參可能通過上調(diào)SOD mRNA的表達(dá)，清除氧自由基，下調(diào)iNOS mRNA的表達(dá)，抑制

20、NO過度產(chǎn)生而對(duì)卵巢移植后的缺血低氧損傷起保護(hù)作用，從而提高卵巢移植后的卵泡存活率。    【參考文獻(xiàn)】  1 Byrne J, Fears TR, Gail MH, et al. Early menopause in long- term survivors of cancer during adolescenceJ. Am J ObstetGynecol,1992,166(3):788-793.    2 Kim SS. Fertility preservation in female cancer

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