關于銀納米顆粒增強腦膠質(zhì)瘤細胞放射敏感性的研究

1、關于銀納米顆粒增強腦膠質(zhì)瘤細胞放射敏感性的研究         11-03-25 10:28:00     編輯：studa20             作者：馬珺，孫新臣，徐睿智，趙迪，童金龍，葛小林【摘要】  目的：通過制備3組尺寸的銀納米顆粒來研究其增強腦膠質(zhì)瘤放射治療的效果。方法:采用檸檬酸鈉還原體系制備20、50和100 nm尺寸的銀顆粒，通過掃描

2、電鏡來表征;檢測3種尺寸的銀納米顆粒的細胞毒性以及確定保證細胞活性的安全劑量;通過MTT比色法和集落形成實驗檢測3組尺寸的銀納米顆粒對腦膠質(zhì)瘤細胞放射治療的效果;通過流式細胞術檢測銀納米顆粒對細胞周期以及細胞放療后凋亡率的影響。結果:20 nm的銀顆粒能夠顯著增強腦膠質(zhì)瘤細胞的放射敏感性，50 nm的銀顆粒次之，而100 nm的銀顆粒無明顯效應。結論:小粒徑的銀納米顆粒能夠增強腦膠質(zhì)瘤細胞的放射敏感性，為臨床放射治療提供新的前景。 【關鍵詞】  銀納米顆粒; 放射增敏; 存活分數(shù); 細胞凋亡Abstract Objective： To study the effect of thre

3、e types of silver nanoparticles on enhancing radiosensitivity of glioma cells. Methods: 20, 50 and 100 nm silver nanoparticles were all prepared in sodium citrate system and were characterized by SEM and TEM. The cytotoxicity was tested and the proper dose was determined to guarantee the little effe

4、ct on cell viability. The effect of silver nanoparticles on radiosensitivity of glioma cells was detected by MTT assay and colonyforming assay. The cell cycles and apoptosis after irradiation were tested by FCM. Results: 20 nm silver nanoparticles significantly sensitized the effect of irradiation t

5、reatment upon cancer cells. 50 nm silver nanoparticles had less effect and 100 nm silver nanoparticles had little. Conclusion: Small size of silver nanoparticle can efficiently enhance cytotoxicity of irradiation of glioma， which provide new prospect for clinical radio therapy.Key words silver nanop

6、articles; enhancing radiosensitivity; survival fraction; apoptosis銀納米顆粒在生物醫(yī)學領域有很多應用價值，它可以作為高性能的抗菌材料1-4、光學傳感器和生物標記物5-7。除此以外，銀納米顆粒還能夠抑制病毒的復制,具備抗病毒的功效8-10。最近一項研究11顯示，銀納米顆粒能夠進入癌細胞線粒體和胞核中，并可以直接對癌細胞的線粒體產(chǎn)生毒性，損傷癌細胞的DNA。該研究認為銀納米顆粒破壞了癌細胞線粒體的呼吸作用，增加了活性氧的產(chǎn)物，中止了ATP的合成，反過來導致了DNA的受損。DNA的損傷通過銀納米顆粒和DNA相互作用進一步增大，導致了細

7、胞分裂在G2/M期停滯。因此，銀納米顆粒被認為在癌癥治療中具有開發(fā)的潛力和價值。作者在上述前人研究的基礎上，提出了使用銀納米顆粒作為腫瘤放療的增敏劑，旨在提高腫瘤細胞放射敏感性，增強X射線對腫瘤細胞的殺傷作用。1 材料和方法1.1 銀納米顆粒的制備3種尺寸的銀納米顆粒均從檸檬酸鈉體系、經(jīng)不同的控制還原方法獲得12-13。在掃描電鏡下對顆粒粒徑進行統(tǒng)計分析，確認3種樣品尺寸集中分布于20、50和100 nm。獲得后銀納米顆粒經(jīng)離心處理棄掉原溶液中上清，將顆粒溶于少量新生牛血清中，按照血清 DMEM=19的比例加入DMEM培養(yǎng)基，最后樣品采用0.2 m孔徑的微孔濾膜進行過濾滅菌。1.2 細胞培養(yǎng)U

8、251細胞購自中國科學院上海細胞研究所，置于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 、5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)。RNaseA、DMSO、MTT和PI購自Sigma公司。1.3 MTT比色實驗分組將U251細胞分為銀納米顆粒結合放療組和單純放療組，分為0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 Gy 7個劑量照射組。細胞和銀納米顆粒孵育24 h后接受X射線照射，然后接種至96孔板培養(yǎng)，于48 h后終止培養(yǎng)棄去原細胞培養(yǎng)液，每孔加入100 l新鮮配制的含MTT的無血清培養(yǎng)液，37 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min。選擇570 nm波長，在全自

9、動酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值(A)，記錄結果。1.4 克隆形成實驗分組將U251細胞分為銀納米顆粒結合放療組和單純放療組，分為0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 Gy 7個劑量照射組。細胞和銀納米顆粒孵育24 h后接受X射線照射，然后稀釋至200(04 Gy)或2 000(6 Gy)細胞·孔-1接種至6孔板培養(yǎng)14 d后終止培養(yǎng)，固定、染色。1.5 細胞凋亡檢測將對數(shù)生長期的U251細胞加入AgNPs，37、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后照射，再過48 h后收集約105細胞。用PBS洗滌細胞2次。加入Binding Buffer懸浮細胞。加入Annexin

10、VEGFP混勻后，加入Propidium Iodioe，混勻。室溫、避光、反應15 min。1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測熒光強度，并分析數(shù)據(jù)。1.6 細胞周期檢測將對數(shù)生長期的U251細胞加入AgNPs，37、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后照射，再過48 h后收集約105細胞。用PBS洗滌細胞1次后收集。用70%乙醇固定24 h，4 保存。染色前用PBS洗去固定液。加入RNase A 37 水浴30 min。再加入PI(50 g·ml-1)染色混勻，4 避光30 min。上機檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。1.7 統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 1

11、3.0軟件進行單因素方差分析，組間差異比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結 果2.1 3個尺寸的銀納米顆粒的細胞毒性由于銀納米顆粒能夠在溶液體系中緩釋出銀離子，體系中銀離子的含量取決于銀納米顆粒自身的性質(zhì)(尺寸和表面包覆等)以及顆粒的濃度。游離的銀離子對細胞存在著毒性，銀納米顆粒則存在對細胞劑量依賴的毒性關系。通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)，隨著銀納米顆粒尺寸的增加，IC50值在增大。其中，20 nm的銀顆粒(圖1)在100 g·ml-1以上顯示出明顯的細胞毒性(圖2)。由于銀納米顆粒對細胞存在劑量依賴的毒性關系，本研究在做放療增敏實驗時均采用IC50值的1/5。在這樣低

12、劑量下，銀納米顆粒對細胞活性影響就很微弱。本研究中采用的銀納米顆粒的劑量是20(20 nm)、45(50 nm)和150 g·ml-1(100 nm)。圖1 20 nm的銀納米顆粒SEM圖片F(xiàn)ig 1 SEM image of 20 nm silver nanoparticles圖2 和20 nm的銀納米顆粒共孵育的U251細胞照片F(xiàn)ig 2 The photo of U251 cells treated with 20 nm silver nanoparticles2.2 MTT和集落實驗顯示銀納米顆粒降低細胞照射后的存活率 腦膠質(zhì)瘤細胞和銀納米顆粒共孵育24 h后經(jīng)射線照射處理，

13、然后去除原培養(yǎng)液中的銀納米顆粒，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后，通過MTT分別檢測各組細胞的活性。結果顯示，20 nm和50 nm的銀納米顆粒結合放療組的細胞活性相對單純放療組有明顯的下降，而100 nm的銀顆粒則無明顯變化。其中，20 nm的銀納米顆粒結合X射線對U251細胞活性的影響如圖3所示。圖3 MTT結果顯示和20 nm銀納米顆粒共孵育后，經(jīng)照射U251細胞生存率相對單純放療組明顯下降Fig 3 MTT results showed that the survival rate decreased after U251 cells treated with 20 nm silver n

14、anoparticles and irradiation本研究著重對20 nm的銀顆粒進行進一步的實驗。集落形成實驗是對細胞在放療后增殖能力更精確的驗證實驗。集落實驗顯示，和銀納米顆粒共孵育的細胞在照射射線后生存分數(shù)(集落數(shù)目)相對單純放療組有明顯下降的趨勢(圖4)，這意味著腫瘤細胞經(jīng)銀納米顆粒和X射線共同作用后增殖能力顯著降低。圖4 集落實驗顯示，20 nm銀納米顆粒能夠顯著降低細胞照射后的生存率Fig 4 The colonyforming assay showed that 20nm silver nanoparticles could significantly decrease cell survival rate after irradiation2.3 流式細胞術顯示銀納米顆粒能夠提高細胞照射后的凋亡率 Annexin VPI檢測進一步表明，銀納米顆粒結合放療組的細胞凋亡率相對單純放療組有顯著提高(圖5)。文獻14報道銀納米顆粒能夠引起更多的細胞停止在G2/M期，本研究的結果和其