口腔上皮細胞論文用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選口腔黏膜上皮細胞體外

1、口腔上皮細胞論文：用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選口腔黏膜上皮細胞體外癌變的相關(guān)蛋白摘要目的：探討口腔黏膜上皮細胞在體外癌變不同階段表達的差異蛋白質(zhì)。方法：以口腔黏膜上皮細胞體外癌變模型為對象，采用雙向凝膠電泳技術(shù)和圖像分析軟件PDQuest分離和分析不同階段細胞間的差異蛋白質(zhì)點，采用LC-MS/MS質(zhì)譜分析系統(tǒng)鑒定差異蛋白質(zhì)點，采用Gene Ontology Annotation將已知差異蛋白質(zhì)進行分類。結(jié)果：采用雙向凝膠電泳技術(shù)和圖像分析軟件PDQuest，得到差異蛋白質(zhì)點54個，采用LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定后，共得到候選差異蛋白質(zhì)45個。根據(jù)Gene Ontology Annotation分類，

2、按細胞組成分布最多的差異蛋白質(zhì)位于細胞質(zhì)和細胞膜，按分子功能分布最多的是磷酸酶活性、催化活性、結(jié)構(gòu)分子功能和鈣離子結(jié)合功能，按生物過程分布最多的是代謝過程、細胞信號傳導(dǎo)和細胞黏附與運動。結(jié)論：比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法中的雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)，能夠很好分離和鑒定口腔黏膜上皮細胞體外癌變模型中不同階段細胞的差異蛋白質(zhì)。關(guān)鍵詞口腔鱗癌；體外癌變細胞模型；比較蛋白質(zhì)組學(xué)口腔鱗癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，預(yù)后較差，5年生存率約為50%-60%1-2。隨著生物標志物研究的深入，尋找具有臨床診斷價值或預(yù)后判斷價值的生物標志物，一直是研究的熱點之一。而探索生物標志物在口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，也可為研究口腔鱗

3、癌發(fā)病機制和治療靶標提供依據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)可以從整體角度研究細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)成分、表達水平與修飾狀態(tài)。目前最常用的蛋白質(zhì)組學(xué)方法是比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，主要是雙向凝膠電泳和質(zhì)譜2個核心技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用。本課題的前期研究成功建立了口腔黏膜上皮細胞體外癌變模型3-4，在此基礎(chǔ)上，我們采用比較蛋白組學(xué)研究方法分析口腔黏膜上皮細胞在癌變不同階段的差異蛋白質(zhì)，為進一步的蛋白質(zhì)功能研究奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1細胞培養(yǎng)采用本課題組前期建立的口腔黏膜上皮細胞體外癌變模型的3種主要細胞，即永生化口腔黏膜上皮細胞(HIOEC細胞)、苯并芘誘導(dǎo)HIOEC細胞產(chǎn)生的癌變早期階段細胞(HB56細胞)和誘導(dǎo)產(chǎn)生的典型

4、鱗狀細胞癌細胞(HB96細胞)。HIOEC細胞采用Defined keratinocyte-SFM培養(yǎng)液(Gibco，美國)，HB56和HB96細胞采用含10%胎牛血清(fetalbovine serum，F(xiàn)BS)、1%谷酰胺和1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液(Gibco，美國)，37、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4。1.2細胞蛋白質(zhì)提取L裂解液，冰上超聲破碎細胞，離心12,000×g，90min。使用Bradford法(Bio-Rad protein Dye assay reagent，美國)進行蛋白定量。1.3雙向凝膠電泳(two-dimensional gel elec-trop

5、horesis，2-DE)，設(shè)置等電聚焦程序(17，每根膠條的極限電流5070(A)：250V線性除鹽30min，1000V快速除鹽1h，10000V線性升壓5h，10000V線性聚焦6 h，500V保持(17)。1.4銀染與圖像分析電泳膠采用固定液固定15min，增敏液增敏30min，MilliQ水漂洗3次，每次5min；銀染20min；MilliQ水漂洗2次，每次1min；顯色4min；加入終止液4min，終止反應(yīng)10min。掃描銀染凝膠(Bio-RadGS710 scanner，Bio-Rad，美國)，采用PDQuest軟件分析圖像，蛋白質(zhì)點密度差異超過5倍者被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。1.5

6、質(zhì)譜鑒定，還原30min；冷卻后，用碘代乙酰胺取代DTT離心，暗處烷基化30min；碳酸氫銨洗膠、ACN脫水、離心、干燥各10min，加入110g胰酶，37酶解20h。收集酶解液，25mmol/L碳酸氫銨提取多肽，5%蟻酸、50%氰化甲烷提取3次，收集液體濃縮至20L，采用C18 Zip tips除鹽。×150mm(RP-C18)，檢測方式為正離子，進樣方式為微型噴霧，毛細管溫度為170，Trap柱為Zorbax 300SB-C18 peptide traps(AgilentTechnologies，美國)。1.9；當Charge+2，Xcorr2.2；當Charge+3，Xcorr

7、3.75；其中，Del-CN0.1。2結(jié)果2.1 2-DE分離、分析HIOEC、HB56和HB96細胞之間的差異蛋白質(zhì)點雙向凝膠電泳結(jié)束后，2-DE膠通過銀染，可以較好地顯示HIOEC、HB56和HB96細胞蛋白質(zhì)點的分布情況(圖1)。2.2篩選HIOEC、HB56和HB96細胞之間的差異蛋白質(zhì)點采用PDQuest分析軟件對HIOEC、HB56和HB96細胞之間進行兩兩比較，選擇蛋白質(zhì)豐度差異倍數(shù)在5倍以上的蛋白質(zhì)點，并與原始2-DE膠進行比對，合并重復(fù)的蛋白質(zhì)點，共得到用于進一步質(zhì)譜分析的差異蛋白質(zhì)點54個，其中位于HIOEC細胞2-DE膠的差異蛋白質(zhì)點29個，位于HB56細胞2-DE膠的差

8、異蛋白質(zhì)點3個，位于HB96細胞2-DE膠的差異蛋白質(zhì)點22個(圖2)。2.3差異蛋白質(zhì)點的鑒定以1號差異蛋白質(zhì)點為例，經(jīng)過膠內(nèi)酶解、收集、提取、濃縮和除鹽后，采用LC-MS/MS鑒定肽段，其總離子流圖(圖3)提示具有相對高豐度的肽段，經(jīng)過MS/MS分析，得到相應(yīng)的肽段序列(圖3)。將所有鑒定出的肽段序列，經(jīng)過Bioworks軟件搜索IPI hu-man蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，確定吻合率最高的蛋白質(zhì)為候選差異蛋白質(zhì)，即Calcyclin(S100A6)。其中，與Cal-cyclin蛋白質(zhì)吻合的肽段數(shù)有14條，排除重復(fù)的肽段，獨特性的肽段數(shù)有6條，這6條肽段與Calcyclin氨基酸序列(MACPLDQA

9、IGLLVAIFHKYSGKEGDKNTLSKKELKELIQKELTIGPKLQDADIAKLMDDLDRNKDQVVNFQEYVTFLGALALIYNDALKG，黑色橫線部分為吻合的氨基酸序列組合)吻合率達到36.67%(表1)。最終的候選差異蛋白質(zhì)匯總起來有45個。在45個差異蛋白質(zhì)中，位于HIOEC細胞雙向凝膠電泳膠中的差異蛋白質(zhì)有26個，分別是CDNAFLJ40018 fis、clone STOMA2006398(Q8N849)、Cal-cyclin(S100A6)、Profilin 2(PFN2)、Thioredoxin-likeprotein 4A(TXNL4A)、S100 ca

10、lcium binding proteinA8(S100A8)、Interferon-induced 17 kDa protein pre-cursor(ISG15)、Acid phosphatase 1(ACP1)、40S ribo-somal protein S12(RPS12)、Lactoylglutathione lyase(GLO1)、Intermediate filament protein family protein(KRT7)、Superoxide dismutaseMn(SOD2)、Peroxire-doxin-1(PRDX1)、ETHE1 protein,mitochon

11、drial pre-cursor(ETHE1)、Prefoldin subunit 3(VBP1)、NADH-ubiquinone oxidoreductase 24 kDa subunit(NDUFV2)、Growth factor receptor-bound protein 2(GRB2)、Proteasome subunit beta type 3(PSMB3)、Triosephosphate isomerase(TPI1)、Ran-specific GT-Pase-activating protein(RANBP1)、Tumor protein D54(TPD52L2)、Delta3

12、,5-delta2,4-dienoyl-CoA isomerase(ECH1)、44 kDa protein-ENSP00000319797、Zyxin(ZYX)、Annexin I(ANXA1)、Nuclear protein Hcc-1(HCC1_HUMAN)和Poly(rC)-binding protein 2(PCBP2)；位于HB56細胞雙向凝膠電泳膠中的差異蛋白質(zhì)有3個，分別是Annexin A2(ANXA2)、Cofilin(CFL)和KRT17 protein(KRT17)，而位于HB96細胞雙向凝膠電泳膠中的差異蛋白質(zhì)有19個，分別是Galectin-1(LGALS1)、En

13、hancer of rudimentary ho-molog(ERH)、Profilin 2(PFN2)、Rribosomal proteinP2(RPP2)、Stathmin(STMN1)、Ran-specific GTPase-activating protein(RANBP1)、Cathepsin B(CTSB)、U-biquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1(UCHL1)、Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T)beta subunit 1(GNB1)、F-actin capp

14、ing pro-tein alpha-1 subunit(CAPZA1)、Mannose-6-phos-phate receptor-binding protein 1(M6PRBP1)、Maspinprecursor(SERPINB5)、LIM and SH3 domain protein1(LASP1)、Tubulin beta-2 chain(TUBB2C)、AnnexinA2(ANXA2)、Pyruvate dehydrogenase EI beta subunit(PDHB)、Elongation factor 2(EEF2)、Elongation factorTu,mitochon

15、drial precursor(TUFM)和Glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)。2.4鑒定蛋白質(zhì)的分類根據(jù)蛋白質(zhì)的功能，將以上鑒定出的已知差異蛋白質(zhì)進行分類，采用的分類方法是GO注釋(Gene O-tology Annotation)，主要分為3大類，分別與細胞組成(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物過程(biologic process)相關(guān)，具體分類結(jié)果見表2。3討論比較蛋白質(zhì)組學(xué)是生命科學(xué)蛋白組學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，它可用來研究疾病的發(fā)病機制，尋找疾病診斷、治療和預(yù)

16、后的靶標。腫瘤細胞往往由正常細胞轉(zhuǎn)變而來，在其轉(zhuǎn)變過程中或者轉(zhuǎn)變前后，某些蛋白質(zhì)在表達數(shù)量、表達水平或修飾狀態(tài)上會出現(xiàn)顯著差異，導(dǎo)致或促進正常細胞向腫瘤細胞轉(zhuǎn)變。比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對于篩選差異蛋白質(zhì)具有明顯的優(yōu)勢，它不但可以比較出差異蛋白質(zhì)，而且可能發(fā)現(xiàn)某些腫瘤相關(guān)的特異性生物標志物，作為腫瘤診斷的分子標記、腫瘤治療和藥物開發(fā)的靶點或判斷腫瘤預(yù)后的生物標志物。比較蛋白質(zhì)組學(xué)在口腔鱗癌方面的應(yīng)用研究起步較晚，從細胞水平研究具有一定的優(yōu)越性。細胞培養(yǎng)具有相對獨立性，可以得到性質(zhì)相同的純化研究對象，避免間質(zhì)成分的干擾；能夠較好地體現(xiàn)腫瘤本身存在的異常，而且可重復(fù)性較好，生長速度可以控制，是腫瘤研究中

17、必不可少的環(huán)節(jié)。本課題組先前建立的國內(nèi)首個口腔黏膜上皮細胞體外癌變模型，包括永生化上皮細胞(HIOEC)、苯并芘誘導(dǎo)產(chǎn)生的癌變早期階段細胞(HB56)和誘導(dǎo)后產(chǎn)生的典型鱗狀細胞癌細胞(HB96)3-4?；诖四Ｐ?，我們應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較口腔黏膜上皮細胞體外癌變過程中的差異蛋白質(zhì)的表達情況，共鑒定出45個不同的差異蛋白質(zhì)，其中24個差異蛋白質(zhì)在HIOEC細胞中表達升高，2個差異蛋白質(zhì)在HB56細胞中表達升高，16個差異蛋白質(zhì)在HB96細胞中表達升高，另外3個差異蛋白質(zhì)在2種細胞中都被鑒定出來，其中HB96和HB56細胞中都鑒定出來的差異蛋白質(zhì)是Annexin A2(ANXA2)，在HI

18、OEC和HB96細胞中都鑒定出來的差異蛋白質(zhì)是Profilin 2(PFN2)和Ran-specific GTPase-activating protein(RANBP1)。HB56和HB96細胞中表達都升高的差異蛋白質(zhì)，可能與口腔黏膜上皮細胞的癌變存在一定的相關(guān)關(guān)系，而HIOEC和HB96細胞中表達都升高的差異蛋白質(zhì)可能沒有顯著差異，但是也可能存在蛋白質(zhì)修飾或降解引起的分子量和等電點差異。因此，需要對以上差異蛋白質(zhì)做進一步驗證研究。另外，根據(jù)蛋白質(zhì)的功能，將其中的已知差異蛋白質(zhì)采用GO注釋(Gene Ontology Annotation)的分類方法，主要分為3大類，分別與細胞組成、分子功能

19、和生物過程相關(guān)。Gene Ontology(GO)是GeneOntology Consortium建立起來的數(shù)據(jù)庫，旨在建立一個適用于各種物種、對基因和蛋白質(zhì)功能進行限定和描述、并隨著研究的不斷深入而更新的語言詞匯標準5。GO是多種生物學(xué)本體論語言中的一種，作為一種整合性分類系統(tǒng)，提供了3層結(jié)構(gòu)的子層次，用于描述基因及其產(chǎn)物的功能，包括細胞組成、分子功能及生物過程6。而這3個子層次下面又可以獨立出不同的亞層次，層層向下構(gòu)成一個ontologies的樹型分支結(jié)構(gòu)?？梢哉f，GO是生物學(xué)的統(tǒng)一化工具。GO最初是從3個模式生物數(shù)據(jù)庫的整合開始：FlyBase7、Saccharomyces Genome

20、 Database8(SGD)和Mouse Genome Informatics9-10(MGI)，以后逐漸與其他數(shù)據(jù)庫建立聯(lián)系和鏈接，其定義法則也已經(jīng)在多個合作的數(shù)據(jù)庫中使用，包括SwissPROT、GenBank、EMBL、DDBJ、PIR、MIPS、SCOP和ENSYME等，這使得在這些數(shù)據(jù)庫中的查詢具有極高的一致性。GO注釋往往在大量基因和蛋白質(zhì)分類中被用到，并且可以得到有價值的信息，為進一步研究提供線索11-15。我們對45個差異蛋白質(zhì)進行分類后，從細胞組成分類來看，這些差異蛋白質(zhì)主要位于細胞質(zhì)內(nèi)，位于各個細胞器、細胞核和細胞膜的差異蛋白質(zhì)較少。從分子功能分類來看，參與磷酸酶活性、催

21、化活性、脫氫酶活性、RNA處理、鈣離子結(jié)合功能、結(jié)構(gòu)分子功能、SH3/SH2結(jié)合活性、Mn超氧化物酶活性等的差異蛋白質(zhì)都有。從生物過程分類來看，差異蛋白質(zhì)主要參與細胞代謝、細胞信號傳導(dǎo)、細胞凋亡、細胞黏附與運動、細胞轉(zhuǎn)運、細胞發(fā)育、細胞骨架形成、細胞增殖和基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等。通過GO注釋，可以大致了解差異蛋白質(zhì)參與了哪些細胞功能和生物過程，以及大致位于細胞的哪一部位，為深入研究提供線索。當然，正如目前所用的其他分子生物學(xué)技術(shù)一樣，比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也可能出現(xiàn)誤差16。為了能夠確切反映比較蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，我們還需要對鑒定的差異蛋白質(zhì)進行驗證，包括細胞水平和組織水平，探討它們在口腔鱗癌細胞和組

22、織中的差異表達情況，以及相應(yīng)的臨床應(yīng)用價值。參考文獻1Kademani D.Oral cancerJ.Mayo Clin Proc,2007,82:878-887.2Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002J.CA Cancer J Clin,2005,55:74-108.3Sdek P,Zhang ZY,Cao J,et al.Alteration of cell-cycle regulato-ry proteins in human oral epithelial cells immortalized by

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