人巨細(xì)胞病毒體外感染誘導(dǎo)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡

1、人巨細(xì)胞病毒體外感染誘導(dǎo)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡            人巨細(xì)胞病毒體外感染誘導(dǎo)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡    2008-5-9 11:56:31                       &

2、#160;                             【摘要】  本研究探討人巨細(xì)胞病毒(hCMV)體外感染是否可引起早幼粒細(xì)胞的增殖、分化抑制、誘導(dǎo)其凋亡，并探討其作用機(jī)制。 采用hCMV AD169 株體外感染早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL60，用PCR 檢測hCMV DNA，用形態(tài)學(xué)觀察、DNA

3、 片段化檢測及Annexin /PI 染色流式細(xì)胞儀檢測等方法分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明： hCMV AD169 株在體外能明顯抑制早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL60的生長，抑制程度與病毒感染滴度呈劑量依賴關(guān)系；PCR 檢測發(fā)現(xiàn)病毒感染組HL60 細(xì)胞中有hCMV IEA 的表達(dá)；形態(tài)學(xué)觀察和DNA 片段化檢測證實(shí)了細(xì)胞凋亡的存在；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示HL60 細(xì)胞凋亡率隨培養(yǎng)液中病毒濃度的加大和感染時(shí)間的延長而增高，二者呈依賴關(guān)系。結(jié)論： hCMV AD169株在體外可直接感染HL60 細(xì)胞；hCMV AD169 株在體外感染HL60 細(xì)胞后，可抑制HL60 細(xì)胞的分化和增殖；hCMV AD16

4、9 株體外感染HL60 細(xì)胞后可誘導(dǎo)其凋亡，且凋亡率與病毒劑量及作用時(shí)間呈依賴性關(guān)系。     【關(guān)鍵詞】  人巨細(xì)胞病毒 早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 病毒感染         Human Cytomegalovirus Induces Apoptosis of Human Promyelocytic Leukemic Cells via Direct Infection In Vitro      &

5、#160;     Abstract    The study was purposed to investigate the proliferation  and the suppression effect of human cytomegalovirus (hCMV) on human promyelocyte cell line HL60, and to study whether hCMV can induce apoptosis of HL60  via direct infection in

6、 vitro  and its mechanism. Promyelocyte cell line HL60 and hCMV AD169 strain were cocultured. PCR was used to detect the direct infection of HL60 cells by hCMV IEA expression. The apoptosis cells were analyzed by morphologic observation, DNA ladder formation,  flow cytometry  with Ann

7、exin /PI stain. The results indicated that hCMV AD169 suppressed the differentiation and proliferation of HL60 cells in vitro significantly (P<0.05). The suppression was dosedependent. hCMV DNA was successfully detected in HL60 cells of viral infection groups by PCR. The apoptotic cells were conf

8、irmed by morphologic observation and DNA ladder formation. The results of flow cytometry showed that the percentage of apoptotic cells increased along with the increase of hCMV titer and the time after infection.  It is concluded that the  promyelocyte can be infected directly by hCMV AD16

9、9 strain. hCMV AD169 strain inhibited the differentiation and proliferation of promyelocyte.  The apoptosis of HL60 cells can be induced  by hCMV infection. With the increase of viral infectious titer and the time after infection，the percentage of apoptotic cells also increase and produce

10、in dosedependent and time dependent manner. Induced apoptosis may be one of the mechanisms of granulocytopenia  induced by hCMV infection.        Key words     human cytomegalovirus; promyelocytic leukemic cell; apoptosis; virus infection&#

11、160;           人巨細(xì)胞病毒（hCMV）是一種在人群中廣泛存在的病毒，兒童是其原發(fā)感染的最主要的人群，受感染者的造血、血液系統(tǒng)是主要受累部位之一。對(duì)hCMV感染的研究，特別是對(duì)于器官移植后hCMV感染的研究，一直是國際上醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。如今，hCMV感染已被認(rèn)為是骨髓移植和白血病化療失敗的主要原因之一。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)hCMV和造血細(xì)胞作用的研究多集中于CFUGM、CFUE、CFUMix及CFUMK方面，實(shí)驗(yàn)證實(shí)hCMV對(duì)各系造血祖細(xì)胞的分化和增殖均有抑制作用2，3。hCMV是否能誘

12、導(dǎo)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡的問題尚無定論，國內(nèi)尚未有類似研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采 用hCMV體外感染早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系HL60，研究hCMV對(duì)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的影響，并初步探討其作用機(jī)制。        病毒        hCMV AD169株取自        人巨細(xì)胞病毒體外感染誘導(dǎo)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡    2008-5-9

13、 11:56:31                                                 資料

14、用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）記錄，各組間采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較，各實(shí)驗(yàn)組在不同的時(shí)間段進(jìn)行比較。        結(jié)    果        PCR擴(kuò)增各實(shí)驗(yàn)組中hCMV DNA        收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，抽提DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在2%的瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外燈下觀察， 各實(shí)驗(yàn)組均可見一

15、條特異性擴(kuò)增條帶，約599 bp，而對(duì)照組未見陽性條帶，提示病毒直接感染細(xì)胞，細(xì)胞中存在hCMV DNA（圖1）。        Figure 1.  Expression of hCMV IEA in HL60 cells infected with hCMV.   M： marker.  Lane 1，2，3： 10-1，10-2，10-3  groups.    C：control group.    

16、;    各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間的細(xì)胞存活率        在感染后3、5、7天，收集各組的部分細(xì)胞，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，監(jiān)測細(xì)胞存活力。結(jié)果顯示：隨著病毒濃度的加大，感染后時(shí)間的延長，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率下降，對(duì)照組不受影響（圖2）。        Figure 2. Effect of hCMV AD 169 on the survival rate  of HL60 cells at different days.

17、60;       Giemsa染色細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察        hCMV感染細(xì)胞后，經(jīng)Giemsa染色至感染后第5天，光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，實(shí)驗(yàn)組中有些細(xì)胞透亮度減低，細(xì)胞膜皺縮、核碎裂，提示有凋亡改變。各實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)量略有不同，對(duì)照組未見明顯凋亡細(xì)胞（圖3） 。        Figure 3. Effect of hCMV AD 169 on the morphology of HL60

18、 cells with Giemsa stainning.  A,B:  morphology of infected cells. C:  morphology of control cells.    DNA斷裂檢測        分別于感染后3、5、7天收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，粗提DNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察，在感染后第5天、7天，可見典型的DNA梯形條帶，隨著感染劑量的加大， 條帶逐漸明顯（圖4）。     

19、0;  Figure 4. DNA fragmentations in hCMVinfected HL60 cells.  M: marker. C: control group. Lane 1 ,2 ,3: 10-1，10-2，10-3 groups.        Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測        分別于感染后3，5，7天收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，經(jīng)處理后進(jìn)行凋亡檢測，記錄凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組的凋亡率明顯高于對(duì)

20、照組，且隨著劑量的加大、時(shí)間的延長，凋亡率逐漸增加（表1）。        Table 1. Apoptosis rate of  HL60 cells  infected with hCMV   (Anxiexin V/ PI)  (n10,  ±SD)            PI染色流式細(xì)胞儀分析    

21、    分別于感染后3、5、7天收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，經(jīng)處理后進(jìn)行凋亡檢測，可見位于G1期前的亞二倍體峰，即為凋亡細(xì)胞群，記錄凋亡率。觀察發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組的凋亡率明顯高于對(duì)照組，且隨著劑量的加大，時(shí)間的延長，凋亡率逐漸增加（表2）。         討    論        許多實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，hCMV感染對(duì)造血祖細(xì)胞各系的分化、增殖均有抑制作用，并可誘導(dǎo)其凋亡2，3。hCMV感染細(xì)胞過程中首先

22、附著于細(xì)胞表面，在合適的離子和PH條件下，借其包膜蛋白（gB和gH）與細(xì)胞表面受體（低結(jié)合力的肝素受體和高結(jié)合力的蛋白受體）結(jié)合后，通過受體介導(dǎo)的機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。也可通過其他途徑如直接穿過胞漿膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，病毒DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)增殖，復(fù)制其核酸和蛋白質(zhì)，產(chǎn)生子代，同時(shí)造成組織病變5。通過檢測宿主細(xì)胞內(nèi)的病毒核酸和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可反映病毒對(duì)宿主細(xì)胞的直接感染，目前實(shí)驗(yàn)中通常使用PCR檢測細(xì)胞的hCMV DNA 和用RTPCR檢測hCMV自我復(fù)制的即刻早期（immediateearly， IE）mRNA的兩種方法，以判斷病毒是否侵入宿主細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采取具有速度快，特異性強(qiáng)，

23、靈敏度高的PCR檢測感染后HL60細(xì)胞內(nèi)的hCMV DNA。實(shí)驗(yàn)過程中，按照步驟用hCMVDNA試劑盒抽提感染組和對(duì)照組細(xì)胞的核酸提取物，PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增后，經(jīng)電泳顯示特異性條帶，各感染組特異性條帶均陽性，DNA片段長度約599bp，與理論上設(shè)計(jì)的引物6 (P1: 5' ATGGAGTCCTCTGCCAAGAGA 3'  P2: 5' CAGCATGTGCTCCTTGAT 3')應(yīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物基本一致，對(duì)照組中未見特異性條帶，表明hCMV AD169株可直接感染HL60細(xì)胞。      &#

24、160; 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:病毒感染組HL60細(xì)胞的集落形成均出現(xiàn)不同程度的減少，表明hCMV AD169株實(shí)驗(yàn)株對(duì)HL60細(xì)胞的分化、增殖具有抑制作用。hCMV體外感染的HL60細(xì)胞受到了病毒損傷，其抑制程度與病毒感染濃度及時(shí)間有關(guān)，隨著感染時(shí)間延長，病毒濃度加大，細(xì)胞受損程度在增大，呈劑量依賴性，抑制程度與病毒感染濃度呈正相關(guān)。國外有研究小組曾觀察到hCMV感染對(duì)HL60細(xì)胞的凋亡無明顯誘導(dǎo)作用。Moon等7報(bào)告hCMV Towne株體外感染HL60細(xì)胞，病毒對(duì)HL60細(xì)胞的凋亡影響不明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hCMV AD169株可明顯引起HL60細(xì)胞發(fā)生凋亡。這可能與所用的病毒株類以及病毒

25、濃度不同有關(guān)。曾有研究者發(fā)現(xiàn)hCMV毒株的不同導(dǎo)致感染后造血祖細(xì)胞hCMV DNA的表達(dá)不同8。        hCMV感染所引起的損傷中，宿主細(xì)胞凋亡較為常見9。有研究表明，hCMV感染誘導(dǎo)的造血祖細(xì)胞生長抑制與細(xì)胞凋亡有關(guān)系。Sindre等10用hCMV感染造血祖細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸的表達(dá)減少，特異性的DNA凋亡片段數(shù)目增加，表明hCMV感染同樣可以誘導(dǎo)造血祖細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)用目前比較成熟的定性法和定量法從這三個(gè)方面對(duì)hCMV體外感染HL60細(xì)胞株誘導(dǎo)凋亡進(jìn)行定性定量的檢測。結(jié)果表明：hCMV AD169株體外

26、感染能誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡，并隨時(shí)間延長、病毒濃度的加大而上升。本實(shí)驗(yàn)中hCMV AD169株體外感染誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡，但其凋亡由哪種凋亡蛋白所介導(dǎo)，其作用位點(diǎn)在哪里，這些蛋白在其中起什么作用，以及如何阻斷其凋亡，尚需今后的研究工作進(jìn)一步深入探討。         【參考文獻(xiàn)】  1邵濟(jì)鈞. 巨細(xì)胞病毒. 見：聞?dòng)衩分骶? 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)微生物學(xué).上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社. 1999：925-9372Reusser P, Einsele H, Lee J, et al. Randomized mu

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