豬糞和土壤樣品中微生物DNA提取方法的比較

1、塑畜塑獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜生態(tài)學(xué)分會(huì)年學(xué)術(shù)會(huì)議論文集三墮豬糞和土壤樣品中微生物提取方法的比較吳銀寶史金才藍(lán)小花陳文燕（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州）摘要隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的迅猛發(fā)展，豬場(chǎng)的糞污排放量急劇增加，在一定程度上對(duì)土壤微生物多樣性造成影響為了可以選用同一種提取方法研究豬糞對(duì)土壤微生物的影響，本文選用了化學(xué)裂解法和試劑盒法從土壤樣品和豬糞樣品中提取微生物的總，并對(duì)這兩種方法提取的效果進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)這兩種方法的有效性結(jié)果表明，試劑盒法無(wú)法用于提取土壤中的微生物；可以從豬糞中提取到，擴(kuò)增能得到目的產(chǎn)物，但重復(fù)性不高化學(xué)裂解法處理土壤樣品，提取的濃度高但純度低，純化后土壤樣品的損失程度不同，但純度有

2、所增加，為后續(xù)的反應(yīng)提供了濃度較高的微生物樣品模板，擴(kuò)增結(jié)果重復(fù)性不高；處理豬糞樣品，提取的濃度較低但純度比較高，擴(kuò)增結(jié)果比較理想由此可見(jiàn)，化學(xué)裂解法用來(lái)提取豬糞樣品中的微生物是可行的，但需尋求更好的土壤樣品微生物提取辦法關(guān)鍵詞豬糞；土壤；提?。晃⑸锒鄻有宰陨鲜兰o(jì)八十年代以來(lái)，我國(guó)畜牧業(yè)特別是養(yǎng)豬業(yè)迅猛發(fā)展，規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)在提高生產(chǎn)效率的同時(shí)，豬糞、污水排放量急劇增加，給畜牧場(chǎng)環(huán)境衛(wèi)生帶來(lái)極大的困難，成為環(huán)境中重要的污染源之一。另外，在豬日糧中添加的抗生素、重金屬、微量元素、激素、鎮(zhèn)靜劑或興奮劑等，以及濫用違禁獸藥和超量用藥，都會(huì)增加豬糞尿等排泄物對(duì)環(huán)境生物的威脅程度。目前對(duì)豬糞的處理以利用為

3、主，即與種植業(yè)相結(jié)合作為有機(jī)肥或?qū)⑵渥鳛轸~(yú)的餌料，這就可能導(dǎo)致土壤中微生物種類(lèi)及數(shù)量發(fā)生變化。同時(shí)有研究表明，自然環(huán)境中微生物物種問(wèn)經(jīng)常發(fā)生基因及質(zhì)粒等遺傳因子的水平轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的基因可與宿主基因重組形成具有特異功能的優(yōu)勢(shì)微生物類(lèi)群，以適應(yīng)改變了的環(huán)境【一，而且還可將這種優(yōu)勢(shì)的微生物類(lèi)群從環(huán)境中分離、純化，應(yīng)用于污染環(huán)境的生物修復(fù)工程【列。因此在土壤中長(zhǎng)期施用豬糞，會(huì)對(duì)土壤微生物多樣性造成何種變化，這種變化會(huì)不會(huì)影響陸生生態(tài)系統(tǒng)的基本功能，都值得人們?nèi)パ芯亢吞接憽Ｄ壳俺２捎梅肿由飳W(xué)技術(shù)進(jìn)行微生物多樣性的研究，這些技術(shù)的前提是要獲得高濃度、大片斷、多樣性程度高、具有代表性的微生物，因此提取微生物

4、在研究中就顯的尤為重要刮。已報(bào)道的分別從土壤和豬糞樣品中提取的方法有很多種，前者有張瑞福等【】的高鹽抽提法、陳敏的凍融一溶菌酶結(jié)合法、黃婷婷等陰的間接法等；后者有黃俊文的小珠撞擊法和酶解法，劉健華【】等的珠磨法、凍融研磨法和酶法等，另外一些大型生物公司還分別研發(fā)出了土壤提取和豬糞提取的商業(yè)試劑盒。本文采用兩種提取方法對(duì)土壤和豬糞的微生物總進(jìn)行了提取，采用技術(shù)擴(kuò)增提取中的細(xì)菌片斷，以綜合評(píng)價(jià)這兩種方法對(duì)土壤和豬糞微生物的提取效果。材料與方法實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)樣品采自東莞某豬場(chǎng)，具體情況如表所示?！净痦?xiàng)目】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校長(zhǎng)基金資助項(xiàng)目作者簡(jiǎn)介】吳銀寶（。），男，博士，主要從事家畜生態(tài)學(xué)研究

5、。蚴。中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜生態(tài)學(xué)分會(huì)年學(xué)術(shù)會(huì)議論文集表實(shí)驗(yàn)所用樣品樣品代號(hào)采集方法號(hào)樣號(hào)樣號(hào)樣號(hào)樣號(hào)樣隨機(jī)在豬舍周?chē)盏夭杉韺油寥溃ǎ┎杉┯眠^(guò)豬糞的菜地表層土壤（）在豬場(chǎng)水塘周?chē)總€(gè)水樣采集點(diǎn)附近采集淤泥在糞污處理池周?chē)杉桃悍蛛x后的糞渣在肉豬舍里面采集豬糞藥品與試劑磷酸鹽、乙二胺四乙酸（）、三（羥甲基）氨基甲烷（，）（）、十六烷基三乙基溴化銨（）、（氯化鈉）、蛋白酶（）、氯仿、冰無(wú)水乙醇、雙蒸水、緩沖液、超純水等；的：先將用水加熱助溶，邊加邊攪拌，加幾滴鹽酸調(diào)值至，定容至升；提取緩沖液：配比為磷酸鹽（），（），：玻璃珠膠回收試劑盒（產(chǎn)品號(hào)：）：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；柱離心式

6、環(huán)境樣品抽提試劑盒（廠）：上海申能生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；、引物和（見(jiàn)表）、聚合酶、緩沖液（為）。表用于，的引物注：引物由上?；瞪锕こ坦竞铣稍囼?yàn)方法與步驟豬糞和土壤微生物的提取化學(xué)裂解法：采用略加修改后化學(xué)裂解法羽直接從土壤和豬糞樣品中提取基因組。稱(chēng)取土壤（豬糞）樣品，放在小三角瓶中，加入提取緩沖液和蛋白酶（）。下振蕩后，加入的，水浴，水浴過(guò)程中每搖勻一次。將上述樣品處理液轉(zhuǎn)移到的離心管中，以（）離心后收集上清液，加入：的氯仿抽提上清液，）離心后在上清液中加入：的預(yù)冷的無(wú)水乙醇過(guò)夜沉淀，（）離心，用雙蒸水或緩沖液溶解沉淀即為所得的基因組粗提液。試劑盒法：取動(dòng)物糞便（土壤），用柱離心式環(huán)

7、境樣品抽提試劑盒，按照操作說(shuō)明抽提樣品基因組。土壤樣品微生物基因組純化采用上海生工產(chǎn)的玻璃珠膠回收試劑盒（產(chǎn)品號(hào)：），按照操作說(shuō)明對(duì)其進(jìn)行純化。濃度的測(cè)定粗提液用紫外分光光度計(jì)測(cè)和的值，確定各個(gè)樣品的含量和純中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜生態(tài)學(xué)分會(huì)年學(xué)術(shù)會(huì)議論文集度，按需加超純水，保證每個(gè)樣品的濃度一致。擴(kuò)增山擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：山（），山緩沖液（為），引物，不同用量的模板（分別為，與止）和（相當(dāng)于，）聚合酶。反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性；交性；退火；延伸；個(gè)循環(huán)，最后延伸。產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，成像后以為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果分析兩種方法提取樣品微生物的效果豬糞和土壤樣品微生物的提取結(jié)果見(jiàn)表和表。結(jié)果表明，化學(xué)裂解法提取的

8、濃度比試劑盒法的高，說(shuō)明采用化學(xué)裂解法裂解土壤和豬糞樣品可以獲得濃度較高的。用試劑盒法提取的號(hào)土壤樣品的濃度均為，說(shuō)明試劑盒法無(wú)法提取出土壤樣品中的，處理豬糞樣品的效果也不明顯（表）。從表還可以看出，化學(xué)裂解法提取土壤的濃度要比提取的豬糞中的濃度高。表兩種方法提取樣品的濃度（）由于蛋白質(zhì)在處有吸收峰，計(jì)算的比值可以確定所提的中蛋白質(zhì)的污染程度，比值越大，越純，反之，比值越低，蛋白質(zhì)污染越嚴(yán)重【。純度檢測(cè)結(jié)果表明（見(jiàn)表），兩種方法提取的豬糞純度均比較高，但所提取的徊值低于，表明還是受到了蛋白質(zhì)的污染，而用化學(xué)裂解法提取的土壤純度相對(duì)較低。純化是獲取高純度微生物總的關(guān)鍵步驟。本研究采用玻璃珠膠回收

9、試劑盒對(duì)提取的進(jìn)行純化，從表和表可以看到，純化后濃度除號(hào)豬糞樣品外均大幅度降低，中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜生態(tài)學(xué)分會(huì)年學(xué)術(shù)會(huì)議論文集而、和號(hào)樣品的純度有所提高，號(hào)樣品的純度下降，而號(hào)樣品純化后全部損失。擴(kuò)增結(jié)果兩種方法提取的電泳圖見(jiàn)圖和圖，由于所提雜質(zhì)比較多，結(jié)果不是很理想（見(jiàn)表），其具體原因分析見(jiàn)表。 圖化學(xué)裂解法提取純化后結(jié)果和、和、和、和、和分別對(duì)應(yīng)、號(hào)樣品 圖化學(xué)裂解法（未純化）和試劑盒法提取樣品的結(jié)果為化學(xué)裂解法初提未純化樣品的電泳圖為試劑盒法提取樣品的電泳圖和、和、和、和、和分別對(duì)應(yīng)、號(hào)樣品和、和、和、和、和分別對(duì)應(yīng)、號(hào)樣品表兩種提取方法電泳圖的分析結(jié)果中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜生態(tài)學(xué)分會(huì)年學(xué)

10、術(shù)會(huì)議論文集表結(jié)果原因分析討論微生物提取方法的有效性從角度分析土壤和豬糞樣品的微生物多樣性，關(guān)鍵在于的提取。的提取方法很多，主要包括物理、化學(xué)和酶促等方法。判斷所提取的有效性主要根據(jù)幾個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)，如細(xì)胞的裂解效率、得率、純度和的大小等【本研究采用了濃度和純度這個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)化學(xué)裂解法和試劑盒法這兩種提取方法的有效性。微生物的濃度和純度受地理位置、操作系統(tǒng)、實(shí)驗(yàn)方法等多種因素影響，其中細(xì)胞裂解方法和緩沖液這兩種因素的影響最為重要。常用的細(xì)胞裂解法可分為物理法、化學(xué)法和酶法，這幾種方法可以根據(jù)具體情況搭配使用。有研究表明，單純使用一種細(xì)胞裂解方法，很難得到令人十分滿意的效果，適當(dāng)?shù)慕M合使用可獲得高

11、質(zhì)量的【。本實(shí)驗(yàn)所用的化學(xué)裂解法，將酶法和物理法結(jié)合來(lái)裂解微生物的，而試劑盒法僅僅用石英沙振蕩裂解，所以化學(xué)裂解法的裂解效果比較好。純化及擴(kuò)增土壤有機(jī)質(zhì)中含有腐殖酸，由于它的分子大小和理化性質(zhì)與相似，所以從土壤中提取的微生物總中往往伴有腐殖酸的污染。而腐殖酸對(duì)后續(xù)的分子生物學(xué)操作，如擴(kuò)增有很大的影響，即使少量的腐殖酸都會(huì)抑制擴(kuò)增反應(yīng)，使反應(yīng)得不到任何產(chǎn)物。因此，在反應(yīng)之前，必須對(duì)土壤樣品的基因組粗提液進(jìn)行純化【】。本研究采用上海生工的玻璃珠膠回收試劑盒對(duì)土壤樣品的基因組粗提液進(jìn)行了純化，雖然純化后每種樣品的產(chǎn)量損失程度不一，但純化后的樣品的腐殖質(zhì)等反應(yīng)抑制劑的含量有所降低（純化后純度增大），從

12、而為后續(xù)的反應(yīng)提供了濃度較高的基因組樣品模板，但結(jié)果并不是很理想。結(jié)論化學(xué)裂解法處理土壤樣品，提取的微生物濃度高但純度低，純化后進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)結(jié)果不理想；處理豬糞樣品，提取的濃度低但純度高，擴(kuò)增結(jié)果比較理想，可見(jiàn)，化學(xué)裂解法可用于提取豬糞樣品中的微生物。 中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜生態(tài)學(xué)分會(huì)年學(xué)術(shù)會(huì)議論文集 試劑盒法不能提取土壤樣品中的微生物；提取的豬糞樣品的微生物濃度較低，但能 進(jìn)行擴(kuò)增。 參考文獻(xiàn) 【】 ， ： 。，： 【】張惠文，張倩茹，周啟星等分子微生物生態(tài)學(xué)及其研究進(jìn)展應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，（）： 】 ， ， （）： ， ， ， ： ： 【】 ， ， ， ，（）： 【】 ， ， ： 。，（）： 【張瑞福，曹慧，崔中利等土壤微生物總的提取和純化微生物學(xué)報(bào)，（）： 【】陳敏土壤樣品中提取方法的比較微生物學(xué)雜志，。（）： 【】黃婷婷，曹慧，王興祥等一種土壤微生物總的高效提取方法土壤，（）： 【】黃俊文甘露寡糖對(duì)仔豬生長(zhǎng)、免疫和腸道微生態(tài)的影響華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文， 【劉健華，陳杖榴，李云等腸道菌群多樣性變性梯度凝膠電泳分析法的建立中國(guó)獸醫(yī)科技，（）： 【羅海