畢赤酵母實(shí)驗(yàn)操作手冊【精選文檔】

1、畢赤酵母實(shí)驗(yàn)操作手冊【精選文檔】畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)手冊大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)最突出的優(yōu)點(diǎn)是工藝簡單、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低。然而,許多蛋白質(zhì)在翻譯后,需經(jīng)過翻譯后的修飾加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等過程才能轉(zhuǎn)化成活性形式。大腸桿菌缺少上述加工機(jī)制，不適合用于表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)。另外，蛋白質(zhì)的活性還依賴于形成正確的二硫鍵并折疊成高級(jí)結(jié)構(gòu),在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)往往不能進(jìn)行正確的折疊，是以包含體狀態(tài)存在。包含體的形成雖然簡化了產(chǎn)物的純化，但不利于產(chǎn)物的活性,為了得到有活性的蛋白，就需要進(jìn)行變性溶解及復(fù)性等操作,這一過程比較繁瑣，同時(shí)增加了成本。與大腸桿菌相比，酵母是低等真核生物，具有細(xì)胞生長

2、快，易于培養(yǎng)，遺傳操作簡單等原核生物的特點(diǎn),又具有真核生物時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確加工，修飾，合理的空間折疊等功能，非常有利于真核基因的表達(dá),能有效克服大腸桿菌系統(tǒng)缺乏蛋白翻澤后加工、修飾的不足。因此酵母表達(dá)系統(tǒng)受到越來越多的重視和利用。大腸桿菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)前已商業(yè)化的基因工程產(chǎn)品大多是通過大腸桿菌表達(dá)的,其主要優(yōu)點(diǎn)是成本低、產(chǎn)量高、易于操作。但大腸桿菌是原核生物，不具有真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和蛋白質(zhì)的加工修飾能力,其產(chǎn)物往住形成沒有活性的包涵體，需要經(jīng)過變性、復(fù)性等處理，才能應(yīng)用.近年來，以酵母作為工程菌表達(dá)外源蛋白日益引起重視，主更是因?yàn)榻湍甘菃渭?xì)胞真核生

3、物，不但具有大腸桿菌易操作、繁殖快、易于工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)，還具有真核生物表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)調(diào)控和蛋白修飾功能，避免了產(chǎn)物活性低，包涵體變性、復(fù)性等等間題1。 與大腸桿菌相比，酵母是單細(xì)胞真核生物,具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，人們對(duì)釀酒酵母（Saccharomyces。Cerevisiae)分子遺傳學(xué)方面的認(rèn)識(shí)最早，釀酒酵母也最先作為外源基因表達(dá)的酵母宿主1981年釀酒酵母表達(dá)了第一個(gè)外源基因一干擾素基因，隨后又有一系列外源基因在該系統(tǒng)得到表達(dá)。雖然干擾素和胰島素已大量生產(chǎn)并在人群中廣泛應(yīng)用,但很大部分表達(dá)由實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)展到工業(yè)規(guī)模時(shí)，培養(yǎng)基中維特質(zhì)粒高拷貝數(shù)的選擇壓力消

4、失，質(zhì)粒變得不穩(wěn)定，拷貝數(shù)下降，而大多數(shù)外源基因的高效表達(dá)需要高拷貝數(shù)的維特,因此引起產(chǎn)量下降.同時(shí),實(shí)驗(yàn)室用培養(yǎng)基復(fù)雜而昂貴，采用工業(yè)規(guī)模能夠接受的培養(yǎng)基時(shí),往往導(dǎo)致產(chǎn)量的下降。為克服釀酒酵母的局限，人們發(fā)展了以甲基營養(yǎng)型酵母（methylotrophic yeast）為代表的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)2.甲基營養(yǎng)型酵母包括：Pichia、Candida等以Pichia.pastoris（畢赤巴斯德酵母）為宿主的外源基因表達(dá)系統(tǒng)近年來發(fā)展最為迅速,應(yīng)用也最為廣泛，已利用此系統(tǒng)表達(dá)了一系列有重要生物學(xué)活性的蛋自質(zhì)。畢赤酵母系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，原因在于該系統(tǒng)除了具有一般酵母所具有的特點(diǎn)外，還有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)1

5、、2、3； 具有醇氧化酶AOX1基因啟動(dòng)子,這是目前最強(qiáng),調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一。 表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合.（即同源重組） 菌株易于進(jìn)行高密度發(fā)酵,外源蛋白表達(dá)量高. 畢赤酵母中存在過氧化物酶體,表達(dá)的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對(duì)細(xì)胞的毒害作用. Pichia。pastoris基因表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過近十年發(fā)展，已基本成為較完善的外源基因表達(dá)系統(tǒng),具有易于高密度發(fā)酵,表達(dá)基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中，能使產(chǎn)物有效分泌并適當(dāng)糖基化，培養(yǎng)方便經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn).利用強(qiáng)效可調(diào)控啟動(dòng)子AOX1，已高效表達(dá)了HBsAg、TNF、EGF、破傷風(fēng)毒素 C片段、基因工程抗

6、體等多種外源基因，證實(shí)該系統(tǒng)為高效、實(shí)用、簡便，以提高表達(dá)量并保持產(chǎn)物生物學(xué)活性為突出特征的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，而且非常適宜子擴(kuò)大為工業(yè)規(guī)模4。目前美國FDA已能評(píng)價(jià)來自該系統(tǒng)的基因工程產(chǎn)品，最近來自該系統(tǒng)的Cephelon制劑已獲得FDA批準(zhǔn),所以該系統(tǒng)被認(rèn)為是安全的 Pichia.pastoris表達(dá)系統(tǒng)在生物工程領(lǐng)域?qū)l(fā)揮越來越重要的作用，促進(jìn)更多外源基因在該系統(tǒng)的高效表達(dá)，提供更為廣泛的基因工程產(chǎn)品2、3。 近年來，Invitrogon公司開發(fā)了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的系列產(chǎn)品，短短幾年已經(jīng)有300多種外源蛋自在該系統(tǒng)得到有效表達(dá),被認(rèn)為是目前最有效的酵母表達(dá)系統(tǒng). 畢赤酵母宿主菌常用的有GS

7、115和KM71兩種，都具有HIS4營養(yǎng)缺陷標(biāo)記.其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位點(diǎn)被ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉(zhuǎn)化方法。 Pichia.pastoris酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒,所以表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)5包括啟動(dòng)子、外源基因克隆位點(diǎn)、終止序列、篩選標(biāo)記等。表達(dá)載體都是穿梭質(zhì)粒，先在大腸桿菌復(fù)制擴(kuò)增,然后被導(dǎo)入宿主酵母細(xì)胞。為使產(chǎn)物分泌胞外，表達(dá)載體還需帶有信號(hào)肽序列。 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)有多種分泌型表達(dá)質(zhì)粒,有許多蛋白在

8、畢赤酵母得到了高效分泌表達(dá)。胞外表達(dá)需要在外源蛋白的N末端加上一段信號(hào)肽序列，引導(dǎo)重組蛋白進(jìn)入分泌途徑，可使蛋白蛋白質(zhì)在分泌到胞外之后獲得準(zhǔn)確的構(gòu)型。畢赤酵母對(duì)外源蛋白自身的信號(hào)序列識(shí)別能力差，在本試驗(yàn)中所使用pPICZA質(zhì)粒，其信號(hào)肽來自釀酒酵母的交配因子(factor)，能很好的達(dá)到以上的要求。并且作為新一代的畢赤酵母分泌表達(dá)質(zhì)粒，它還擁有一個(gè)特點(diǎn)是其具有Zeocin抗性標(biāo)記基因，給我們篩選轉(zhuǎn)化子的工作帶來很大的便利1、2。 pPICZA質(zhì)粒是作為新一代的畢赤酵母分泌表達(dá)質(zhì)粒，它的主要特點(diǎn)簡介如下： 具有強(qiáng)效可調(diào)控啟動(dòng)子AOX1（alcohol oxidase,醇氧化酶）; 具有Zeoci

9、n抗性篩選標(biāo)記基因，重組轉(zhuǎn)化子可直接用Zeocin進(jìn)行篩選，即在YPDZ平板上生長的轉(zhuǎn)化子中，100都有外源基因的整合，大大簡化了重組轉(zhuǎn)化酵母的篩選過程5。在操作過程中,Zeocin也可用來篩選含表達(dá)載體pPICZA的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，不必另外使用Amp，經(jīng)濟(jì)而又簡便；。 在表達(dá)載體A0X1 5端啟動(dòng)子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)下游有A0X1 3端終止序列； 分泌效率強(qiáng)的信號(hào)肽factor. Invitrogen公司開發(fā)的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的系列產(chǎn)品作為目前被應(yīng)用為最為廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng),其主要的優(yōu)點(diǎn)有：醇氧化酶可調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子，能高密度發(fā)酵,重組蛋白表達(dá)量高。外源基因整合

10、在酵母基因組上,可以穩(wěn)定存在。同時(shí)，高效分泌表達(dá)質(zhì)粒能將外源蛋白表達(dá)后，進(jìn)行翻譯后加工處理，將外源蛋白分泌到細(xì)胞外，不但提高表達(dá)蛋白的活性，而且，有利于產(chǎn)物的純化。一畢赤酵母表達(dá)常用溶液及緩沖液的配制11 各種母液的配制10YNB (含有硫酸銨、無氨基酸的13。4酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基) 4保存.34g酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基(無硫酸銨）+100g硫酸銨，溶于1000ml水中，過濾除菌。500*B （0。02%生物素 Biotin) 4保存 保存期為1年。20mg的生物素溶于100ml水中，過濾除菌。100H （0.4Histidine 組氨酸） 4保存 保存期為1年.400mg的L組氨酸溶于100ml

11、水中，(加熱至50以促進(jìn)溶解），過濾除菌。10D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期為1年.200g葡萄糖溶于1000ml水中，滅菌15min或過濾除菌。10*M （5%Methanol 甲醇） 保存期為2個(gè)月。將5ml的甲醇與95ml水混勻，過濾除菌。10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期為1年以上。將100ml甘油和900ml水混勻后，高壓滅菌或過濾除菌。100AA （0.5 of each Amino Acid，各種氨基酸) 4保存 保存期為1年。分別將500mg的L-谷氨酸、L蛋氨酸、L賴氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸溶于100ml水中，過濾除菌。1M 磷酸鉀溶液

12、（potassium phosphate buffer,pH6.0),將1mol/L的K2HPO4溶液132ml與1mol/L的KH2PO4溶液868ml混勻,其pH為6。0，如需調(diào)節(jié)pH，則使用磷酸和氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH.1.2 常用溶液及緩沖夜1.2.1 堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA所用溶液：溶液：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA,25mmol / L TrisHCI （pH 8。0)溶液：0.2molL NaOH，1 SDS（臨用時(shí)配制）溶液：29。44g KAc，11。5ml Acetic acid，加ddH2O至100 ml。4保存.1。2.2 10 甘油

13、 （Glycerol）:將100ml甘油和900ml水混勻后,高壓滅菌或過濾除菌.保存期為1年以上.1.2。3 RnaseH2O:1ul Rnase 加入1ml 滅菌 dd H2O。4保存。1。2.4 TE緩沖液：10mmol / Tris-CI（pH 80）， lmmol / L EDTA(pH 8。0)1。2.5 STE緩沖液:0。1mol / L, 10mmol / L Tris-HCl （pH 8。0)， 1mmol / L EDTA （pH 8。0）1.2.6 SCE緩沖液：1mol / L Sorbitol （山梨醇）， 10mmol / L 檸檬酸鈉 ， 10mmol / L E

14、DTA1.2。7 1M potassium phosphate buffer （pH 6。0)： 132 ml 1M K2HPO4 868 ml 1M KH2PO41.2.8 50X TAE 瓊脂糖凝膠電泳緩沖液，pH 8.0（1L)： 242 g Tris 57。1 ml Acetic Acid 37。2 g EDTA二畢赤酵母表達(dá)的培養(yǎng)基配制52.1 LB（LuriaBertani）培養(yǎng)基： Trypton l Yeast Extract 0。5 NaCl l PH 7.0制作平板時(shí)加入 2瓊脂粉。121高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４?。用于培養(yǎng)pPICZA原核宿主菌TOP10F時(shí)可加入

15、Zeocin 25ug / ml。2.2 LLB（Low Salt LB）培養(yǎng)基: Trypton l Yeast Extract 0。5 NaCl 0。5 PH 7.0制作平板時(shí)加入 2%瓊脂粉.121高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４鏀?shù)月。用于培養(yǎng)pPICZA原核宿主菌TOP10F時(shí),加入Zeocin 25ug / ml，可以4條件下保存12周。2.3 YPD （又稱YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培養(yǎng)基） Trypton 2%

16、dextrose (glucose） 2%+agar 2%+Zeocin 100 g/ml液體YPD培養(yǎng)基可常溫保存；瓊脂YPD平板在4可保存幾個(gè)月。加入Zeocin 100ug / ml，成為YPDZ培養(yǎng)基，可以4條件下保存12周。2。4 YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)：yeast extract 1%peptone 2dextrose （glucose） 2sorbitol 1 M+agar 2+ Zeocin 100 g/ml不管是液體YPDS培養(yǎng)基，還是YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基，都必須存放4條件

17、下，有效期12周.2。5 MGY Minimal Glycerol Medium （最小甘油培養(yǎng)基)（34%YNB；1%甘油;4105生物素）。將800ml滅菌水、100ml的10YNB母液、2ml的500B母液和100ml的10*GY母液混勻即可,4保存，保存期為2個(gè)月.2.6 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸）在1000ml的MGY培養(yǎng)基中加入10ml的100*H母液混勻，4保存，保存期為2個(gè)月。2。7 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培養(yǎng)基）（含有：1mol/

18、L的山梨醇；2%葡萄糖；1。34%YNB；4*105生物素；0.005氨基酸）1.將186g的山梨醇定容至700ml，高壓滅菌；2.冷卻后于45水??；3。將100ml的10D、100ml的10*YNB；2ml的500B；10ml的100AA等母液和88ml無菌水混勻,預(yù)熱至45后，與步驟2的山梨醇溶液混合.4保存。2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine (葡萄糖再生培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸）在RD培養(yǎng)基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同時(shí)無菌水的體積減少至78ml即可，其余配制方法與RD相同。4保存。2。9 RD及R

19、DH平板的制備1.將186g的山梨醇和1520g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60水??；2。參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10D、100ml的10*YNB；2ml的500B；10ml的100AA等母液、（10ml的100H母液）和88（78）ml無菌水混勻，預(yù)熱至45后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；3.迅速制備平板。4可保存數(shù)月。2.10 RD及RDH 的TOP 瓊脂的制備(常用于酵母菌的包被）1。將186g的山梨醇和7。510g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌;冷卻后于60水浴；2.參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10D、100ml

20、的10YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液)和88(78）ml無菌水混勻，預(yù)熱至45后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；3.將該TOP瓊脂置于45水浴冷卻、保溫,備用.2.11 MD與MDHMinimal Dextrose Medium +(Histidine） 最小葡萄糖培養(yǎng)基 +( 0.004 %組氨酸）（含有：1。34YNB；;4*10-5 生物素;2%葡萄糖)1。100ml的10YNB；2ml的500B和100ml10*D母液，用800ml的無菌水定容至1000ml即可;2。如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可;3。如

21、配制平板，可無菌水的滅菌前，加入1520g的瓊脂。4可保存數(shù)月。2。12 SOC培養(yǎng)基： Trypton l Yeast Extract 0。5 NaCl 0.05 Glucose （1mol / L） 2%121高壓滅菌 20min,冷卻后，4保存三主要試驗(yàn)環(huán)節(jié)的操作3。1 酵母菌株的分離純化 接種GS115于5ml YPD液體培養(yǎng)基,30,200rpm振蕩過夜，涂布 YPD平板，30培養(yǎng)48 小時(shí),用 YNB基本培養(yǎng)基和含His的補(bǔ)充培養(yǎng)基作點(diǎn)種分離純化，挑選在補(bǔ)充培養(yǎng)基生上生長而在基本培養(yǎng)基上不生長的單菌落劃YPD平板，4保存。3。2 pPICZA原核宿主菌TOP10F的活化培養(yǎng)TOP1

22、0F做為菌種保存在70 條件下，在進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)抽提質(zhì)粒之前,先要進(jìn)行活化培養(yǎng)。接種TOP10F于5ml LLB(加入25ug / ml Zeocin)中，37，200 rpm ,培養(yǎng)1618小時(shí)。3。3畢赤酵母表達(dá)的試驗(yàn)方法3.3。1線狀質(zhì)粒DNA的脫磷酸化處理 為了防止載體質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化，用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理酶切后的質(zhì)粒DNA，具體操作如下： 建立反應(yīng)體系：線性化的質(zhì)粒 35ul 10x CIP buffer 4ul CIP 1ul ddH2O 5ul -total 45ul 在PCR儀上控制反應(yīng)溫度(加石蠟油封閉），37,15 min ；50，15 min;56,30 m

23、in（滅活）。 在56未開始前停止，加入proteinse K ，用于滅活CIP,加入試劑如下：反應(yīng)物 45ul10x 5 SDS 7ul10x EDTA (pH 8.0） 7ulproteinse K 5ulddH2O 6ul - total 70ul 純化使用QIAquick spin kit ,按照2.2.3.3步驟進(jìn)行，20 ul 滅菌ddH2O洗脫純化產(chǎn)物。進(jìn)行1瓊脂糖凝膠電泳,120 V, 觀察純化結(jié)果,并大約估計(jì)DNA濃度.3。3。2 E.coli TOP10F 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 取10 ul TOP10F 菌液,接種于 200ml LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，37 ,200

24、 rpm，1618小時(shí).取100 ul菌液接種于 200 ml 液體LB培養(yǎng)基中。 37 ，200 rpm，培養(yǎng)1618小時(shí)。 滅菌500 ml 離心管，4，4000 rpm，20 min 。得菌體沉淀。棄上清，菌體用10甘油重懸并洗滌.重復(fù)洗滌3次。 第三次離心后,棄絕大部分上清，留下約1ml 液體用于重懸菌體。 從制得的感受態(tài)細(xì)胞中，取200 ul于滅菌EP管中，加入連接反應(yīng)產(chǎn)物 5ul ，混勻，不要產(chǎn)生氣泡，在冰上放置 5 min。 將混勻后得200ul菌液移入電擊杯中。 使用電擊穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)化,設(shè)置為 電壓 2500 V,時(shí)間 5 ms. 電擊后,往電擊杯中加入 800ul SOC培養(yǎng)

25、基,沖洗出菌體，轉(zhuǎn)移至滅菌1.5 ml EP管中。37，150 rpm ，輕搖4560 min。 取全部均勻涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLBZeocin平板上，正放，待涂布液不在流動(dòng)，37 培養(yǎng)1216小時(shí).*注:設(shè)空載體做對(duì)照。3.4 畢赤酵母電轉(zhuǎn)化方法3。4。1 菌體的準(zhǔn)備:1。挑取酵母單菌落，接種至含有5ml YPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30、250300r/min培養(yǎng)過夜；2。取100500l的培養(yǎng)物接種至含有500ml新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中,2830、250300r/min培養(yǎng)過夜,至OD600達(dá)到1。31.5;3。將細(xì)胞培養(yǎng)物于4，1500g離心5min，

26、用500ml的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸；4.按步驟3離心，用250ml的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸；5。按步驟3離心，用20ml的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸;6。按步驟3離心,用1ml的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為1.5ml；7。備注：可將其分裝為80l一份的包裝冷凍起來，但會(huì)影響其轉(zhuǎn)化效率（2周之內(nèi)）。3.4。2 電擊轉(zhuǎn)化：8.將520g的線性化DNA溶解在510l TE溶液中，與80l的上述步驟6所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中；9。將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min；10。根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀提供的資料，參考其他文獻(xiàn)及多次摸索,確定合適的電壓

27、、電流、電容等參數(shù)，按優(yōu)化的參數(shù)，進(jìn)行電擊；11.電擊完畢后，加入1ml冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻,轉(zhuǎn)至1.5ml的EP管中；12.將菌體懸液涂布于MD或RDB平板上，每200600l涂布一塊平板；13.將平板置于30培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn).推薦：電壓1.5kV；電容25F;電阻200.電擊時(shí)間為410msec。3。5 Pichia酵母表達(dá)直接PCR鑒定重組子的方法3.5。1 模板的處理:1。平板上的菌落長到肉眼可見時(shí)（約12小時(shí)）；2.將除了模板之外的其它PCR反應(yīng)液的組分準(zhǔn)備好，并分裝。引物最好使用Kit中已有的檢測專用的引物，或者一條使用載體上的引物，一條使用基因的特異性引物（這樣做可

28、以鑒定非定向克隆的方向）；3.用半根滅菌的牙簽（節(jié)約，而且好用）挑取菌落，在PCR管中涮以下,放入一個(gè)滅菌的1.5毫升離心管，對(duì)PCR管和1。5毫升離心管編號(hào)；4。PCR擴(kuò)增,1 agarose電泳；5.對(duì)于PCR擴(kuò)增顯現(xiàn)特異性條帶的克隆，把置于1.5毫升離心管中的半截牙簽扔到5毫升YPDZ培養(yǎng)基中，30度培養(yǎng),812小時(shí)后提質(zhì)粒，酶切鑒定確認(rèn)。 注意:本試驗(yàn)方法應(yīng)用在需要挑取的克隆較多（也就是克隆效率低），使用PCR初篩可以使工作量大為降低.3。5。2 PCR反應(yīng)體系: 以TaKaRa Taq DNA聚合酶反應(yīng)為例：組分50l體系20l體系10xReaction Buffer5。0l2.0l

29、25mmol/L MgCl23.0l1.2l2。5mmol/L dNTPs5.0l3.0lPrimer 1(10mol/L)2.5l1.0lPrimer 2（10mol/L）2.5l1.0lddH2O31。5l12。6lTaq DNA聚合酶0.5l0.2lTOTAL50。0l20。0l3。5.3 PCR反應(yīng)條件:初始變性94 4min變性94 30s34個(gè)循環(huán)退火5054 30s延伸72 30s結(jié)束延伸72 10min保存43.6 畢赤酵母基因組提取方法 接種重組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子于5ml YPDZ培養(yǎng)基, GS115菌于YPD培養(yǎng)基作對(duì)照，30，培養(yǎng)1618小時(shí). 室溫下，1500 g離心510

30、min收集菌體 100 ulTE（pH 7。0）重懸，加入300 ul EDTA（pH 8.0），0.07M TrisHCl，3 ul-巰基乙醇，1ul Lyticase ，37水浴30 min。 10000g離心510min，取沉淀，加90ul TE重懸。 200ul 飽和酚，200ul氯仿,混勻,離心30s ,取上層水相。 加入兩倍體積無水乙醇以及1/10體積的NaAC，20放置30min； 10000g離心20min，棄上清；75乙醇漂洗沉淀一次; 干燥后，加入15 l的TE或H2O溶解，-20備用.3。7 Mut+表型重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)1. 挑選一單菌落，置于裝有25ml MGY、

31、BMG或BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于2830C/250-300 rpm培養(yǎng)至OD600 = 26 (1618 h）；2. 室溫下15003000g離心5min，收集菌體，用MM、BMM或 BMMY重懸菌體，使OD600 =1.0左右（約100200ml)；3。 將步驟2所得的菌液置于1L的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28-30C/250300 rpm的搖床上繼續(xù)生長;4. 每24h向培養(yǎng)基中添加100 甲醇至終濃度為0.51.0%；5. 按時(shí)間點(diǎn)分別取菌液樣品,取樣量為1ml，置于1。5ml EP管中，最大轉(zhuǎn)速離心23min,分別收集上清和菌體,分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳

32、收獲時(shí)間。時(shí)間點(diǎn)一般?。?、6、12、24、36、48、60、72、84和96h;6. 對(duì)分泌表達(dá),分離樣品的上清液；對(duì)胞內(nèi)表達(dá)，分離樣品的菌體沉淀，帶檢測樣品用液氮或干冰速凍后,于80C保存?zhèn)溆茫?. 可以用SDSPAGE、Western-Blot及活性實(shí)驗(yàn)檢測與鑒定重組蛋白的表達(dá)。3。7 Muts表型重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)1。 挑選一單菌落，置于裝有25ml MGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于2830C/250-300 rpm培養(yǎng)至OD600 = 26 (1618 h）；2。 室溫下15003000g離心5min，收集菌體，用1/5到1/10原培養(yǎng)體積的MM、BMM或 B

33、MMY重懸菌體(約1020ml）；3。 將步驟2所得的菌液置于100ml的搖瓶中,用雙層紗布或粗棉布封口,放置于2830C/250-300 rpm的搖床上繼續(xù)生長；4。 每24h向培養(yǎng)基中添加100 甲醇至終濃度為0。51.0；5。 按時(shí)間點(diǎn)分別取菌液樣品，取樣量為1ml，置于1。5ml EP管中，最大轉(zhuǎn)速離心23min，分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間。時(shí)間點(diǎn)一般取：0、24、48、72、96和120h;6。 對(duì)分泌表達(dá),分離樣品的上清液；對(duì)胞內(nèi)表達(dá)，分離樣品的菌體沉淀，帶檢測樣品用液氮或干冰速凍后,于80C保存?zhèn)溆?7。 可以用SDSPAGE、Western-Bl

34、ot及活性實(shí)驗(yàn)檢測與鑒定重組蛋白的表達(dá).四 試驗(yàn)的注意事項(xiàng)4.1信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)的設(shè)計(jì) 以質(zhì)粒pPICZA為例。在利用PCR反應(yīng)在外源基因兩端引入酶切位點(diǎn)的試驗(yàn)中.如果質(zhì)粒pPICZA雙酶切中丟失了KEX2蛋白酶的酶切位點(diǎn)LysArg，應(yīng)該在上游中，增加了編碼Lys、Arg的密碼子AAA、AGA .酵母細(xì)胞膜中中的KEX2蛋白酶是-factor信號(hào)肽的切割酶，它能有效識(shí)別酶切位點(diǎn)LysArg，通過對(duì)信號(hào)肽的切割使基因表達(dá)產(chǎn)物釋放至胞外。4.2 PCR產(chǎn)物酶切保護(hù)堿基的設(shè)計(jì) 利用PCR轉(zhuǎn)換酶切位點(diǎn)，通過P3、P4兩引物的擴(kuò)增在rhEGF的兩端加上Xho、Xba的識(shí)別位點(diǎn)和5個(gè)保護(hù)堿基。根據(jù)限制性核

35、酸內(nèi)切酶的工作原理，內(nèi)切酶首先需要結(jié)合到核苷酸序列上,并在上面進(jìn)行滑行,直至識(shí)別到酶切位點(diǎn)，為了能使內(nèi)切酶有效的結(jié)合到序列上以利于其的有效加工。在利用PCR進(jìn)行酶切位點(diǎn)轉(zhuǎn)換的時(shí)候,通常應(yīng)在5端限制酶位點(diǎn)外再加3個(gè)保護(hù)堿基GC6,防止引物合成中因?yàn)楹铣尚屎图兓瘑栴}而導(dǎo)致的酶切位點(diǎn)的殘缺。核苷酸保護(hù)堿基之為了保證限制型內(nèi)切酶的工作效率,在其識(shí)別位點(diǎn)的兩側(cè)應(yīng)該保證一定的旁側(cè)序列，換言之,識(shí)別位點(diǎn)是限制型內(nèi)切酶識(shí)別并特異性切割底物的必要而不充分的條件。鑒于NEB(New England Biolabs)公司在限制酶領(lǐng)域的總體研究水平和對(duì)保護(hù)堿基方面的獨(dú)到理解,在設(shè)計(jì)引物時(shí)可以參照NEB公司的產(chǎn)品目錄

36、后面的附錄:Cleavage to the end of DNA fragments進(jìn)行7，但是，一些不常用的酶或雖有推薦的保護(hù)堿基序列但酶切效率仍不高的酶還是很難設(shè)計(jì)保護(hù)堿基。本次實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)美國基因動(dòng)力實(shí)驗(yàn)室文獻(xiàn)的報(bào)道8；XbaI、NheI和SpeI位點(diǎn)5端保護(hù)堿基須在5個(gè)左右才容易被酶切割，以及一些前人的經(jīng)驗(yàn)總結(jié),我們在設(shè)計(jì)引物時(shí)在識(shí)別位點(diǎn)5端，設(shè)計(jì)了5個(gè)保護(hù)堿基。以保證較高的酶切效率。4。3高保真DNA聚合酶的使用 Vent DNA聚合酶是從高溫嗜熱菌中分高出的高保真（High Fidelity）耐高溫 DNA聚合酶,能糾正 DNA擴(kuò)增中產(chǎn)生的錯(cuò)誤，而傳統(tǒng)的Taq DNA聚合酶，Tth

37、 DNA聚合酶及其變體 AmpliTaq，KlenTaq等都無3至5糾錯(cuò)功能，因此在擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)堿基錯(cuò)配的機(jī)率為 2。1x104。這對(duì)于大批量的PCR產(chǎn)物而言，并不是十分嚴(yán)重的問題，因?yàn)橛滞瑯渝e(cuò)誤的DNA分子僅占全部合成的DNA分子群體的極少一部分。但是，如果PCR擴(kuò)增的DNA片段是用于分子克隆,那么這就是件值得重視的事情，因?yàn)榇朔N分子含有一個(gè)或數(shù)個(gè)錯(cuò)誤摻入的核苷酸,那么在該克隆中的所有克隆DNA都將帶有同樣的“突變”。將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果9.具有校正功能的 DNA聚合酶還有Pfu，Deep Vent，Pwo，UlTma等，Pfu是其中出錯(cuò)率最低的，比Taq DNA聚合酶低10倍.在本論文中，為了

38、減少hEGF 在 PCR過程的錯(cuò)誤擴(kuò)增，在人工合成hEGF的過程中使用了Vent DNA聚合酶.隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展成熟(擴(kuò)增長度、保證性、產(chǎn)量和特異性等）,質(zhì)粒構(gòu)建過程的大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制將被PCR這一細(xì)胞外的DNA復(fù)制所代替，質(zhì)粒構(gòu)建效率將有質(zhì)的飛躍。4。4密碼子的偏好性的原則 酵母菌對(duì)外源基因的表達(dá)也和外源基因密碼子的選用有關(guān)。了解表達(dá)系統(tǒng)宿主在密碼子使用上的偏愛性對(duì)從翻譯水平分析外源基因表達(dá)的規(guī)律有重要意義，也為改造外源基因或改造宿主細(xì)胞提供依據(jù)10、11。4.5線性化及采用電轉(zhuǎn)化的原因:在pPICZA-EGF電轉(zhuǎn)整合入GS115的時(shí)候，因?yàn)樾枰容^高的轉(zhuǎn)染率，我們對(duì)其用限制

39、性內(nèi)切酶Sac進(jìn)行線性化的處理。細(xì)菌內(nèi)同源重組被認(rèn)為是重組質(zhì)粒構(gòu)建過程的難點(diǎn)。因?yàn)槲淳€性化的環(huán)狀質(zhì)粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低，所以重組轉(zhuǎn)移載體必須用特定的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理。這種處理的目的： 防止隨機(jī)插入重組時(shí)質(zhì)粒在功能區(qū)斷開,造成目的基因表達(dá)失活； 讓同源重組以指定的方式發(fā)生。4。5 乙醇沉淀法的問題主要步驟如下：1）酶切體系（80ul）中2倍體積的無水乙醇加1/10體積的PH5。2 NaAC，混勻2)-20 20分鐘沉淀3）13200rpm，20min,離心后棄上清4)75%乙醇300ul輕輕洗，同上離心5min,棄上清5）37度烘箱至無乙醇?xì)馕叮ɑ蚴怯脫u床的出風(fēng)口吹出的暖風(fēng)吹

40、）。6）20ul ddH2O重溶如果想提高轉(zhuǎn)化效率,可以稍微做一些改進(jìn):1。 還是用酚抽一下，去除內(nèi)切酶；2。 75%乙醇應(yīng)洗兩遍，盡可能去除鹽離子,防止電轉(zhuǎn)化杯被擊穿,同時(shí)可提高效率；3。 在沉淀時(shí)，如用終濃度2。5M的醋酸鈉+2。5倍體積的無水乙醇，可沉淀幾乎所有的DNA,但需要用75的乙醇認(rèn)真的洗兩遍。4.6 酶切的總結(jié)影響重組質(zhì)粒構(gòu)建效率的最關(guān)鍵步驟在于酶切，不管是否是定向克隆還是非定向克隆。酶切的關(guān)鍵在于切干凈，徹底的酶切反應(yīng)是成功的一半,特別是載體的酶切，尤其是雙酶切。 雙酶切一般是先反應(yīng)低鹽buffer的、后反應(yīng)高鹽buffer的,如果低鹽buffer的酶在高鹽buffer的酶的反應(yīng)條件下有低活性(一般來講在NEB的手冊上都有標(biāo)示），最好就先純化(酚/氯仿抽提、乙醇沉淀）過,再進(jìn)行第二次酶切反應(yīng).注意：有相同功能（如：切同一序列，并產(chǎn)生相同末端）的酶，不一