PRRS實(shí)驗(yàn)室診斷監(jiān)測課件

1、PRRS實(shí)驗(yàn)室診斷監(jiān)測技術(shù)實(shí)驗(yàn)室診斷監(jiān)測技術(shù) -RT-PCR檢測技術(shù)檢測技術(shù) 黑龍江省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所黑龍江省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容 PCR 技術(shù)技術(shù) PRRSV RT-PCR 檢測技術(shù)檢測技術(shù)動(dòng)物病毒的組成動(dòng)物病毒的組成兩部分兩部分 1. 1. 蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)：HA、HI、ELISA 2. 核酸：分為兩種核酸：分為兩種 脫氧核糖核酸（脫氧核糖核酸（DNA）-PCR 核糖核酸（核糖核酸（RNA）-RT-PCR PRRS病毒粒子的結(jié)構(gòu)病毒粒子的結(jié)構(gòu)PCR 技術(shù)技術(shù)概念概念 PCR是一種在體外模擬自然是一種在體外模擬自然DNA復(fù)制過復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)，它以待擴(kuò)增的兩條程的核酸擴(kuò)增技

2、術(shù)，它以待擴(kuò)增的兩條DNA鏈為鏈為模板模板，由一對(duì)人工合成的寡核，由一對(duì)人工合成的寡核苷酸苷酸引物引物介導(dǎo)，通過介導(dǎo)，通過DNA聚合酶聚合酶酶促反酶促反應(yīng)，快速體外擴(kuò)增特異應(yīng)，快速體外擴(kuò)增特異DNA序列。序列。 19711971年，年，KhoranaKhorana提出：經(jīng)過提出：經(jīng)過DNADNA變性，與合適變性，與合適引物雜交，用引物雜交，用DNADNA聚合酶延伸引物，并不斷重聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆復(fù)該過程便可克隆tRNAtRNA基因?；?。但由于測序和引物合成的困難，對(duì)熱具有較強(qiáng)但由于測序和引物合成的困難，對(duì)熱具有較強(qiáng)穩(wěn)定性的穩(wěn)定性的DNADNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物

3、聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物的 合 成 仍 處 在 手 工 、 半 自 動(dòng) 合 成 階 段的 合 成 仍 處 在 手 工 、 半 自 動(dòng) 合 成 階 段所以，所以，KhoranaKhorana的設(shè)想被人們遺忘了的設(shè)想被人們遺忘了PCR的最初設(shè)想PCR的實(shí)現(xiàn)PCR的改進(jìn)與完善PCRPCR技術(shù)簡史技術(shù)簡史 PCR的最初設(shè)想PCR的實(shí)現(xiàn)PCR的改進(jìn)與完善19851985年，美國年，美國PE-CetusPE-Cetus公司人類遺傳研究室的公司人類遺傳研究室的MullisMullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCRPCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的

4、DNADNA復(fù)制復(fù)制最初采用大腸桿菌最初采用大腸桿菌DNADNA聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)行PCRPCR，其缺點(diǎn)是：，其缺點(diǎn)是：KlenowKlenow酶不耐高溫，酶不耐高溫，9090會(huì)變性失活，每次循環(huán)會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。都要重新加。引物鏈延伸反應(yīng)在引物鏈延伸反應(yīng)在3737下進(jìn)行，容下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCRPCR產(chǎn)物特產(chǎn)物特異性較差，合成的異性較差，合成的DNADNA片段不均一。片段不均一。 PCRPCR技術(shù)簡史技術(shù)簡史 19881988年年Saiki Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌

5、(thermus aquaticus) (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱中提取到一種耐熱DNADNA聚合酶。此聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：酶具有以下特點(diǎn)：耐高溫，在耐高溫，在7070下反應(yīng)下反應(yīng)2h2h后其殘留后其殘留活性大于原來的活性大于原來的90%90%，在，在9393下反應(yīng)下反應(yīng)2h2h后其殘留活性是原后其殘留活性是原來的來的60%60%，在，在9595下反應(yīng)下反應(yīng)2h2h后其殘留活性是原來的后其殘留活性是原來的40%40%。在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。新酶。大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增

6、加大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度了擴(kuò)增長度(2.0Kb)(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。因而其靈敏性也大大提高。 PCR的最初設(shè)想 PCR的實(shí)現(xiàn) PCR的改進(jìn)與完善基本原理基本原理1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR反應(yīng)條件 PCR的特點(diǎn) 特異性強(qiáng) PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板引物與模板DNA特異正確

7、的結(jié)合；特異正確的結(jié)合； 堿基配對(duì)原則；堿基配對(duì)原則； Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； 靶基因的特異性與保守性。靶基因的特異性與保守性。 靈敏度高 皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平 能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞 病毒檢測的靈敏度可達(dá)3個(gè)PFU 細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌 簡便、快速 一次性加好反應(yīng)液，24 小時(shí)完成擴(kuò)增 擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析 對(duì)標(biāo)本的純度要求低 血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNAPCR的應(yīng)用 研究 基因克隆，DNA測序，分析突變 診斷 細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測，基因診斷 人類基因組工程

8、 遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測序，表達(dá)圖譜 法醫(yī) 犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析 腫瘤 各種腫瘤檢測PRRSV RT-PCR 檢測技術(shù)檢測技術(shù)用途 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測試劑盒，用于檢測豬血清和組織中的PRRSV，適用于PRRSV 的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。原理 利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取 RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA 為模板，以引物為起點(diǎn)合成與RNA 模板互補(bǔ)的cDNA 鏈。在TaqDNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過35 次循環(huán)，最終使擴(kuò)增DNA 片段放大了數(shù)百萬倍。將擴(kuò)增DNA 片

9、段進(jìn)行電泳，經(jīng)染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到DNA 片段的擴(kuò)增帶。反轉(zhuǎn)錄 單管一步法 反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)在一個(gè)管子中完成，得到的全部cDNA產(chǎn)物都一起經(jīng)PCR擴(kuò)增，靈敏度更高，但是容易相互干擾。 兩步法 反轉(zhuǎn)錄和PCR分開做，PCR取反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的1/10進(jìn)行，更為靈活和嚴(yán)謹(jǐn)，但是靈敏度不如前者高。自備的器材 儀器：分析天平、離心機(jī)、儀器：分析天平、離心機(jī)、PCR PCR 擴(kuò)增儀、擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、微波爐、組織研磨器、外分析儀）、微波爐、組織研磨器、-20 -20 冰箱、可調(diào)移液器（冰箱、可調(diào)移液器（2 L2 L、

10、20 L20 L、200 L200 L、1000 L1000 L）。）。樣品的制備 1 1 樣品采集：病死或撲殺的豬，取肺、扁樣品采集：病死或撲殺的豬，取肺、扁桃體和腦等組織；待檢活豬，用注射器取桃體和腦等組織；待檢活豬，用注射器取血血5 mL5 mL。2 28 8 保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測。（要求送檢病料新保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融病料。）鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融病料。） 2 2 樣品處理：每份樣品分別處理。樣品處理：每份樣品分別處理。 2.1 2.1 組織樣品處理：稱取豬組織組織樣品處理：稱取豬組織0.05 g 0.05 g 于于研磨器中研磨，加入研磨器中研磨，加入1.5 mL

11、 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5 mL 1.5 mL 滅菌離心管中，滅菌離心管中，8000 rpm 8000 rpm 離心離心2 min2 min，取上清液，取上清液100 L 100 L 于于1.5 mL 1.5 mL 滅菌離心管中。滅菌離心管中。 2.2 2.2 全血樣品處理：待血凝后取血清全血樣品處理：待血凝后取血清100 100 LL，置，置1.5 mL 1.5 mL 滅菌離心管中。滅菌離心管中。 2.3 2.3 陽性對(duì)照處理：取陽性對(duì)照陽性對(duì)照處理：取陽性對(duì)照100 L100 L，置置1.5 mL 1.5 mL 滅菌離心管中。滅菌離心

12、管中。 2.4 2.4 陰性對(duì)照處理：取陰性對(duì)照陰性對(duì)照處理：取陰性對(duì)照100 L100 L，置置1.5 mL 1.5 mL 滅菌離心管中。滅菌離心管中。操作步驟 1 病毒RNA 的提取 1.1 取已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，分別加入裂解液600 L，充分顛倒混勻，室溫靜置35 min。 1.2 將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時(shí)堵 塞吸附柱），13000 rpm 離心30 s，棄去收集管中液體，套上收集管。 1.3 向吸附柱中加入600 L 洗液，13000 rpm 離心30 s，棄去收集管中液體，套上收集管。 1.4 重復(fù)步驟1.3。

13、1.5 再空柱13000 rpm 離心2 min。 1.6 將吸附柱移入新的1.5 mL 離心管中，在膜中央加入洗脫液25 L，室溫靜置1 min，13000 rpm 離 心30 s，獲得總RNA。 2 RT-PCR 操作程序 每份總體積 20 L，含16.8 L RT-PCR 反應(yīng)液（用前混勻），1.2 L 酶混合液，2 L 模板RNA。 例如：n 份樣品（n10），配制n+1 份，16.8（n+1）RT-PCR 反應(yīng)液，再加入1.2（n+1）酶 混合液混勻，取18 L 分裝成n 份，分別加入2 L 模板RNA，加入礦物油20 L 覆蓋（有熱蓋的PCR 擴(kuò)增儀不用加礦物油），作好標(biāo)記。 在

14、PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序：42 45 min，94 3 min；擴(kuò)增條件為94 30 s，55 30 s， 72 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 延伸7 min。3.電泳 稱 3 g 瓊脂糖放于500 mL 錐形瓶中，加入50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液200 mL（取4 mL 50 倍 TAE 電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至200 mL），于微波爐中熔解，再加入10 L 染色液混勻。在電泳槽 內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10 L 點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110120V 電壓于50 倍稀釋的TAE 電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。結(jié)果判定 陽性對(duì)照出現(xiàn)436 bp 擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)436 bp 擴(kuò)增帶為豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性，否則為陰性。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 1所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處理，以免污染實(shí)驗(yàn)室。 2PCR 整個(gè)試驗(yàn)分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。流程順