幽門螺桿菌感染對胃粘膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

1、    幽門螺桿菌感染對胃粘膜上皮細(xì)胞增殖 和凋亡的影響        摘要為研究幽門螺桿菌（Hp）感染對胃粘膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討胃粘膜上皮細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，采用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）技術(shù)、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）免疫組織化學(xué)染色對Hp陽性患者Hp根除前后及Hp陰性者胃粘膜上皮中增殖細(xì)胞、凋亡細(xì)胞進(jìn)行原位觀察和比較。結(jié)果Hp陽性患者胃粘膜細(xì)胞增殖指數(shù)、凋亡指數(shù)均顯著增加，Hp根除后，上述指標(biāo)均顯著降低

2、，而Hp仍為陽性者上述指標(biāo)則無顯著性變化。胃粘膜細(xì)胞增殖指數(shù)與凋亡指數(shù)呈顯著正相關(guān)。提示Hp誘導(dǎo)胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡可能是刺激胃粘膜上皮細(xì)胞過度增殖的機(jī)制之一，使胃粘膜的不穩(wěn)定性增加，從而增加患胃癌的危險(xiǎn)性。關(guān)鍵詞螺桿菌，幽門胃粘膜細(xì)胞凋亡增殖細(xì)胞核抗原EFFECTOFHELICOBACTERPYLORIONGASTRICEPITHELIALCELLPROLIFERATIONANDAPOPTOSISLiuHaifeng，LiuWeiwen，F(xiàn)angDianchun，etalDepartmentofGastroenterology，South-WestHospitalMilitaryMedical

3、University，Chongqing400038AbstractThisstudywasattemptedtohaveanunderstandingofrelationshipbetweenHelicobacterpylori（Hp）andproliferationaswellasapoptosisofgastricepithelidcells，andbetweencellproliferationandapoptosisEndoscopicmucosalbiopsiesweretakenin72caseswithchronicgastritisWithHppositive（n46）bio

4、psieswererepeatedafterHperadication；incasesofHpnegative（n26）specimensfromthesomesitesobtaimedTerminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUTPnickendlabelling（TUNEL）techniqueandproliferativecellnuclearantigen（PCNA）immunohistochemicalstainingwereappliedforinvestigationResultsshowedthat：（1）Hpinfectiondi

5、dinducecellproliferationandapoptosisinparalle；（2）HpinfectedmucosademonstratedveryhighapoptoticandPCNAlabellingindices，whichdeclinedaftertherapyItissupposedthatHpinducedcellapoptosismaybeatiggerfactorforcellhyperproliferation，resultingincarcinogenesisKey wordsHelicobacterpyloriGastricmucosaApoptosisP

6、roliferationcellnuclearantigen近年眾多流行病學(xué)資料表明幽門螺桿菌（Hp）感染與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，但對其致癌機(jī)理尚未闡明。我們采用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）技術(shù)1、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）免疫組織化學(xué)染色對Hp陽性患者Hp根除前后及Hp陰性者胃粘膜上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡進(jìn)行原位觀察，研究Hp感染對胃粘膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以及胃粘膜細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，以探討Hp可能的致癌機(jī)理。 材料和方法1研究對象：均為以上消化道癥狀在我院行胃鏡檢查的慢性胃炎患者，共72例，用活檢鉗采取胃粘膜組織標(biāo)本。Hp檢測包括尿素酶試驗(yàn)、

7、細(xì)菌培養(yǎng)和Warthy-Starry銀染色，上述方法有2項(xiàng)以上陽性視為Hp陽性，全部均為陰性者判為Hp陰性。對Hp陽性者給予有機(jī)鉍劑、呋喃唑酮、羥氨芐青霉素三聯(lián)藥物進(jìn)行治療，治療結(jié)束后復(fù)查胃鏡，停藥4周后Hp仍保持陰性者為Hp根除。2胃粘膜上皮凋亡細(xì)胞的原位檢測：試劑盒（Insitucelldeathdetectionkit，POD）為德國BoenrigerMannheim公司產(chǎn)品。染色步驟：（1）切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；（2）0.3H2O2封閉30分鐘阻斷內(nèi)源酶；（3）20mgL蛋白酶K消化液作用25分鐘；（4）滴加TUNEL反應(yīng)液，37，60分鐘；（5）滴加過氧化物酶連接的抗熒光素

8、抗體，37，30分鐘；（6）DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。以PBS替代TUNEL反應(yīng)液作陰性對照。3PCNA免疫組織化學(xué)染色：采用SP法。PCNA單克隆抗體（PC10）為北京中山公司產(chǎn)品，SP試劑盒為福州邁新公司產(chǎn)品。染色步驟按說明書進(jìn)行。PBS代替一抗作陰性對照。4觀察指標(biāo)：光學(xué)顯微鏡下觀察TUNEL染色及PCNA免疫組化染色切片的顯色反應(yīng)，數(shù)5個(gè)以上高倍視野，不少于1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)及PCNA指數(shù)（增殖細(xì)胞指數(shù)）。5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，兩樣本相關(guān)的比較采用直線相關(guān)分析。結(jié)果1Hp感染對胃粘膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響：TUNEL染色陽

9、性物質(zhì)呈棕黃色，位于細(xì)胞核內(nèi)，濃縮的核質(zhì)緊貼于核膜，或核質(zhì)呈現(xiàn)均勻的染色。PCNA陽性物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀，亦主要位于核內(nèi)，少許細(xì)胞漿內(nèi)有淡著色。Hp陰性患者，胃粘膜上皮凋亡細(xì)胞主要位于表層上皮中；Hp陽性患者，凋亡細(xì)胞可見于胃粘膜全層。PCNA陽性細(xì)胞則主要分布于粘膜中下部腺體中。Hp陽性患者胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)及PCNA指數(shù)均顯著高于Hp陰性患者，見表1，兩組差異均有非常顯著性意義（P0.01）。表1Hp感染與胃粘膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系組別例數(shù)PCNA指數(shù)（，±s）凋亡指數(shù)（，±s）Hp陰性268.31±3.123.03±1.69Hp陽性4614

10、.06±4.62*12.67±8.82*注：Hp：幽門螺桿菌；PCNA：增殖細(xì)胞核抗原；* 與Hp陰性組比較P0.01 2Hp根除前后胃粘膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡的變化：經(jīng)前述三聯(lián)藥物治療后，Hp根除者胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)及PCNA指數(shù)均顯著下降（P0.01），而Hp仍為陽性者凋亡指數(shù)及PCNA指數(shù)亦有降低，但與治療前相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。表2Hp根除前后胃粘膜上皮細(xì)胞PCNA指數(shù)及凋亡指數(shù)的變化組別例數(shù)PCNA指數(shù)（，±s）凋亡指數(shù)（，±s）治療前治療后治療前治療后Hp根除組3614.19±4.359.11±3.17*12.73&

11、#177;7.033.64±2.31*Hp未被根除組1014.34±4.9512.80±4.4212.56±8.158.79±6.56注：Hp：幽門螺桿菌；PCNA：增殖細(xì)胞核抗原；* 與同組治療前比較P0.01 3胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖的關(guān)系：經(jīng)對Hp陽性患者Hp根除前后胃粘膜細(xì)胞凋亡指數(shù)與PCNA指數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析表明胃粘膜上皮細(xì)胞增殖狀態(tài)與細(xì)胞凋亡指數(shù)呈顯著正相關(guān)（P0.05）。討論胃粘膜是由短壽命的細(xì)胞組成的，細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡共同維持其數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡。本組結(jié)果顯示，在Hp陰性患者胃粘膜中，凋亡細(xì)胞主要位于粘膜表層，形成“凋亡細(xì)胞帶

12、”，增殖細(xì)胞主要位于粘膜中下部，形成“增殖細(xì)胞帶”，這種分布特點(diǎn)體現(xiàn)了胃粘膜上皮自基底向表層逐漸成熟、衰老、死亡的生長規(guī)律。Hp陽性患者胃粘膜凋亡細(xì)胞失去了上述分布特點(diǎn)，細(xì)胞凋亡指數(shù)及增殖指數(shù)均顯著增加，提示Hp感染可導(dǎo)致胃粘膜細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)紊亂，使胃粘膜不穩(wěn)定性增加。本研究通過PCNA免疫組化染色方法發(fā)現(xiàn)，Hp陽性患者胃粘膜細(xì)胞PCNA指數(shù)較Hp陰性者明顯增加，Hp根除后PCNA指數(shù)顯著下降，說明Hp感染促進(jìn)了胃粘膜細(xì)胞增殖，與文獻(xiàn)報(bào)道一致2，3。但Hp感染促進(jìn)胃粘膜上皮細(xì)胞過度增殖的機(jī)制尚不清楚。我們采用TUNEL技術(shù)對Hp陽性患者Hp根除前后及Hp陰性者胃粘膜上皮凋亡細(xì)胞進(jìn)行原位觀

13、察，結(jié)果顯示，Hp感染可誘導(dǎo)胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡，胃粘膜細(xì)胞增殖狀態(tài)與細(xì)胞凋亡指數(shù)呈正相關(guān)，提示Hp誘導(dǎo)胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡可能是促進(jìn)胃粘膜細(xì)胞過度增殖的機(jī)制之一。Hp感染增加胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡，為維持細(xì)胞增殖和死亡的動(dòng)態(tài)平衡，胃粘膜上皮發(fā)生代償性增殖反應(yīng)，處于過度增殖狀態(tài)的細(xì)胞更易受致突變、致癌物的損傷而產(chǎn)生具凋亡抗性的細(xì)胞群體，從而破壞胃粘膜上皮細(xì)胞增殖和死亡的動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)胃癌的發(fā)生。Hp感染誘導(dǎo)胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚?？赡芘cHp分泌的細(xì)胞毒素如cagA和vacA等、Hp尿素酶分解尿素產(chǎn)生的氨、Hp感染后炎癥反應(yīng)中釋放的細(xì)胞因子和氧自由基、胃腔中維生素C含量減低有關(guān)4。另外，Hp感

14、染亦可能通過影響細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)而誘導(dǎo)胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡5。具體機(jī)制有待深入研究。總之，Hp感染可能通過誘導(dǎo)胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡，刺激胃粘膜細(xì)胞過度增殖，使其具有較高的癌變易感性，這在胃癌發(fā)生中可能具有重要意義。因此，深入研究Hp誘導(dǎo)胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制，將有助于提高對胃癌發(fā)生的機(jī)理的認(rèn)識。?軍隊(duì)醫(yī)藥衛(wèi)生“九五”重點(diǎn)課題作者單位：400038重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院消化科參考文獻(xiàn)1GavrieliY，ShermanY，ShmuelA，etalIdentificationofprogrammedcelldeathinsituviaspecificlabelingofnuclearDNAfragmentationJCellBiol，1992，119：493-5012FanXG，KelleherD，F(xiàn)anXJ，etalHelicobacterpyloriincreaseproliferationofgastricepithelialcellsGut，1996，38：19-223梁后杰，劉為紋，房殿春，等幽門螺桿菌清除前后胃粘膜增殖狀態(tài)的變化中國實(shí)用內(nèi)科雜志，1996，16：23-244MartinLS，Albe