肝炎的分子診斷與臨床應(yīng)用ppt課件

1、 肝炎分子診斷項(xiàng)目開(kāi)展介紹肝炎分子診斷項(xiàng)目開(kāi)展介紹11、了解肝炎分子診斷2、分子診斷在HBV中的臨床應(yīng)用3、分子診斷在HCV中的臨床應(yīng)用4、ADICON已開(kāi)展的肝炎分子診斷項(xiàng)目2 我國(guó)乙肝病毒感染率概況我國(guó)乙肝病毒感染率概況3 2006200620102010年全國(guó)乙型病毒性肝炎防治規(guī)劃年全國(guó)乙型病毒性肝炎防治規(guī)劃顯示，中國(guó)是乙型肝炎病毒感染和發(fā)病人數(shù)最多的國(guó)顯示，中國(guó)是乙型肝炎病毒感染和發(fā)病人數(shù)最多的國(guó)家，全國(guó)有家，全國(guó)有6.96.9億億人曾感染過(guò)乙肝病毒，其中人曾感染過(guò)乙肝病毒，其中1.21.2億億人人長(zhǎng)期攜帶乙肝病毒。長(zhǎng)期攜帶乙肝病毒。目前全國(guó)慢性乙肝病人目前全國(guó)慢性乙肝病人200020

2、00萬(wàn)萬(wàn)人，每年死于與乙人，每年死于與乙肝相關(guān)的肝病患者達(dá)肝相關(guān)的肝病患者達(dá)2828萬(wàn)萬(wàn)例，發(fā)病率和死亡率都位居例，發(fā)病率和死亡率都位居前三位。每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約達(dá)前三位。每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約達(dá)36003600億億元人民元人民幣。幣。我國(guó)乙肝病毒感染率概況我國(guó)乙肝病毒感染率概況4 在臨床上應(yīng)用核酸（在臨床上應(yīng)用核酸（DNA/RNA) DNA/RNA) 和分子生物和分子生物學(xué)技術(shù)學(xué)技術(shù), , 在基因水平診斷和監(jiān)控疾病情況在基因水平診斷和監(jiān)控疾病情況和療效，評(píng)估疾病的檢測(cè)方法。和療效，評(píng)估疾病的檢測(cè)方法。5HBV HBV 分子診斷的分子診斷的臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用高靈敏度高靈敏度HBV DNA

3、HBV DNA定量定量HBV 感染監(jiān)測(cè)藥物療效檢測(cè)感染早期檢測(cè)HBV HBV 基因分型基因分型病情預(yù)后發(fā)展檢測(cè)抗病毒藥物效果預(yù)測(cè)P P區(qū)耐藥檢測(cè)區(qū)耐藥檢測(cè)抗藥性監(jiān)測(cè)治療藥物選擇S S 區(qū)變異區(qū)變異確定隱覓性病毒變異判斷疫苗效果判斷肝炎預(yù)后C C區(qū)啟動(dòng)子變異區(qū)啟動(dòng)子變異確定病毒變異類型判斷治療效果確定治療方案+高精度病毒載量檢測(cè)系統(tǒng)（ COBAS AmpliPrep/Cobas TaqMan ）7+定量PCR技術(shù)檢測(cè)患者的血清HBVDNA含量，能更準(zhǔn)確地反映病毒復(fù)制程度，對(duì)HBV相關(guān)疾病的診斷、治療、判斷預(yù)后意義重大。+QF-PCR是國(guó)內(nèi)常用的定量檢測(cè)血清HBVDNA水平的方法，COBAS 系統(tǒng)

4、是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于血清HBVDNA定量檢測(cè)的方法。它具有靈敏度高，線性范圍廣，實(shí)時(shí)監(jiān)控，重復(fù)性好，可檢測(cè)A、B、C、D、E、F、G、前C區(qū)變異等多基因型DNA載量?jī)?yōu)點(diǎn)。+由于本QF-PCR試劑盒的線性范圍為1.0 x 103 copiesmL1.0 x 108 copiesmL，對(duì)于低于1.0 x 103 copiesmL標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果不能給出具體拷貝值，有存在漏檢的可能。 而COBAS 系統(tǒng)線性范圍為20-1.7108 IU/mL，因此， COBAS 系統(tǒng)更能準(zhǔn)確反映血清HBV DNA含量。8COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test,

5、 v2.0檢測(cè)靈敏度20 IU/mL 線性范圍20 1.7 x 108 IU/mL檢測(cè)基因型A-H檢測(cè)樣本量650 mLSample Type血清或EDTA抗凝血漿SFDA注冊(cè)證Q39高靈敏度高靈敏度乙肝：乙肝：20 IU/mL準(zhǔn)確判斷治療起點(diǎn)準(zhǔn)確判斷治療起點(diǎn)/ /終點(diǎn)終點(diǎn)線性范圍線性范圍乙肝：乙肝：20-1.720-1.710108 8 IU/mLIU/mL極佳的重復(fù)性，結(jié)果可靠極佳的重復(fù)性，結(jié)果可靠正確指導(dǎo)抗病毒治療正確指導(dǎo)抗病毒治療每批試劑均使用每批試劑均使用WHOWHO標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可溯源性和可溯源性每個(gè)樣本使用同每個(gè)樣本使用同源性內(nèi)標(biāo)定

6、量源性內(nèi)標(biāo)定量避免結(jié)果不準(zhǔn)確避免結(jié)果不準(zhǔn)確采用采用AmpEraseAmpErase酶酶減少交叉污染減少交叉污染目前在目前在國(guó)內(nèi)唯一國(guó)內(nèi)唯一滿足治療指南和專家共識(shí)的滿足治療指南和專家共識(shí)的HBV HBV DNADNA和和 HCV RNAHCV RNA檢測(cè)試劑檢測(cè)試劑10部分病毒學(xué)應(yīng)答部分病毒學(xué)應(yīng)答60 2,000 IU/mL加其他藥物治療每3個(gè)月監(jiān)測(cè)HBV DNA開(kāi)始治療開(kāi)始治療- - 基于基于 HBV DNAHBV DNA、 ALTALT水平和疾病發(fā)展階段水平和疾病發(fā)展階段治療第治療第1212周評(píng)估是否存在原發(fā)性無(wú)應(yīng)答周評(píng)估是否存在原發(fā)性無(wú)應(yīng)答 (較基線下降1 log)治療第治療第2424周評(píng)

7、估周評(píng)估完全病毒學(xué)應(yīng)答完全病毒學(xué)應(yīng)答 2,000 IU/mL改用或加用更強(qiáng)藥物每6個(gè)月監(jiān)測(cè)HBV DNA*Keefe, E. Clin Gastro Hepatology. 2007; (5):890-897. 抗病毒治療應(yīng)將HBV DNA降至盡可能低的濃度，理想是低于實(shí)時(shí)定量 PCR方法（靈敏度靈敏度10-15 IU/mL10-15 IU/mL）的最低檢出限1 1. EASL HBV Guidelines. J Hepatology. 2009;50:277-24211HBsAgHBsAg清除及血清學(xué)轉(zhuǎn)換清除及血清學(xué)轉(zhuǎn)換治療終點(diǎn)治療終點(diǎn)ALTALT正常正常組織學(xué)改善組織學(xué)改善HBV DNAH

8、BV DNA降低降低/ /消失消失HBeAgHBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換血清學(xué)轉(zhuǎn)換HBeAgHBeAg消失消失cccDNA cccDNA 清除清除*Lok, A.S.F et.al. “Chronic Hepatitis B: Update 2009.” HEPATOLOGY, Vol 50, No. 3, 2009, pgs 8-9 12+ 20092009年年EASLEASL指南提出的治療終點(diǎn)：指南提出的治療終點(diǎn)：+最最理想的理想的治療終點(diǎn)：持續(xù)的治療終點(diǎn)：持續(xù)的HBsAg HBsAg 消失，伴或不消失，伴或不伴抗伴抗HBs HBs 抗體出現(xiàn)?？贵w出現(xiàn)。+滿意的滿意的治療終點(diǎn)：在治療終點(diǎn)：在HBe

9、 Ag HBe Ag 陽(yáng)性患者中，出現(xiàn)陽(yáng)性患者中，出現(xiàn)持續(xù)的持續(xù)的HBeAg HBeAg 血清轉(zhuǎn)換血清轉(zhuǎn)換+次級(jí)的滿意次級(jí)的滿意治療終點(diǎn)：盡可能降低病毒治療終點(diǎn)：盡可能降低病毒DNADNA水水平（降至實(shí)時(shí)定量平（降至實(shí)時(shí)定量 PCRPCR檢測(cè)限以下：檢測(cè)限以下：10-10-15IU/ml15IU/ml）13根據(jù)根據(jù)HBVHBV全基因核苷酸序列的差異，分為不同全基因核苷酸序列的差異，分為不同基因型基因型: :A.B.C.D.E.F.G.H共8個(gè)型 不同的基因型具有不同地域分布不同的基因型具有不同地域分布 我國(guó)主要是BC型為主，偶有A型 北方C型特征基因型基因型B B型型C C型型感染性感染性低高

10、HbeAgHbeAg陽(yáng)性率陽(yáng)性率低高HbeAgHbeAg自然清除時(shí)間自然清除時(shí)間短長(zhǎng)HBV DNAHBV DNA載量載量低高致病性致病性輕重HCCHCC發(fā)生率發(fā)生率低（低年齡組高）高（高年齡組高）干擾素治療完全應(yīng)答率干擾素治療完全應(yīng)答率高低抗病毒治療效果抗病毒治療效果高低肝癌手術(shù)治療預(yù)后肝癌手術(shù)治療預(yù)后好差癌栓栓塞治療效果癌栓栓塞治療效果好好差+乙肝病毒:高變異性 1/105 +24h 一萬(wàn)億-十萬(wàn)億拷貝*變異：一千萬(wàn)一億+復(fù)制過(guò)程:DNA-RNA-DNA+HBV逆轉(zhuǎn)錄酶:缺乏嚴(yán)格的校正機(jī)制+變異:自然變異,免疫壓力等等16原本有效的藥物原本有效的藥物對(duì)發(fā)生耐藥變異后的病毒束手無(wú)策對(duì)發(fā)生耐藥變

11、異后的病毒束手無(wú)策變異前，藥物有效抑制病毒變異后，藥物對(duì)病毒束手無(wú)策乙肝病毒乙肝病毒P P區(qū)耐藥區(qū)耐藥1718+長(zhǎng)期使用抗病毒藥物可引起HBV耐藥，引起耐藥的基因突變位點(diǎn)主要集中于P區(qū)+原因：抗病毒藥物作用在病毒P區(qū)藥物靶點(diǎn)上，引起相關(guān)基因變異，使得藥物與相關(guān)靶點(diǎn)作用下降，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥。19原發(fā)無(wú)應(yīng)答原發(fā)無(wú)應(yīng)答病毒學(xué)（部分）病毒學(xué)（部分）應(yīng)答應(yīng)答臨床耐藥2021 耐藥病毒的出現(xiàn)使后續(xù)治療的藥物療效降低耐藥病毒的出現(xiàn)使后續(xù)治療的藥物療效降低 耐藥病毒的出現(xiàn)抵消了之前獲得的臨床益處耐藥病毒的出現(xiàn)抵消了之前獲得的臨床益處病毒反彈病毒反彈, , 血清轉(zhuǎn)氨酶升高血清轉(zhuǎn)氨酶升高, HBeAg, HBeAg

12、血清轉(zhuǎn)換率降低血清轉(zhuǎn)換率降低肝臟病理進(jìn)展肝臟病理進(jìn)展肝硬化病人出現(xiàn)肝功能失代償和死亡肝硬化病人出現(xiàn)肝功能失代償和死亡肝移植后肝炎復(fù)發(fā)率增高肝移植后肝炎復(fù)發(fā)率增高 公共衛(wèi)生危害公共衛(wèi)生危害耐藥病毒株的傳播耐藥病毒株的傳播免疫逃逸免疫逃逸2223拉米夫定拉米夫定, ,阿德福韋阿德福韋, ,恩替卡韋為基因型耐藥發(fā)生率恩替卡韋為基因型耐藥發(fā)生率, ,替比夫定為因耐藥發(fā)生的病毒學(xué)反彈發(fā)生率替比夫定為因耐藥發(fā)生的病毒學(xué)反彈發(fā)生率24+長(zhǎng)期使用抗病毒藥物可引起HBV耐藥，引起耐藥的基因突變位點(diǎn)主要集中于P區(qū)+耐藥基因分析在臨床藥物選擇上的應(yīng)用 目前最常見(jiàn)P區(qū)耐藥位點(diǎn)11個(gè)（169、173、180、181、1

13、84、194、202、204、233、236、250）25 拉米夫定 M204I/V L180M V173L 恩曲他濱 V173L L180M M204I/V 阿德福韋 A181V N236T 恩替卡韋 T184A（G/I/S) M250V 特比夫定 M204I/V常用抗病毒藥物的耐藥位點(diǎn)常用抗病毒藥物的耐藥位點(diǎn)26常見(jiàn)變異的交叉耐藥性敏感敏感界于中間界于中間耐藥耐藥271.一種藥物產(chǎn)生耐藥時(shí)，需要用具有不同耐藥位點(diǎn)藥物代替2.為減少耐藥情況，建議從治療開(kāi)始就使用具有兩種不同耐藥位點(diǎn)藥物一起治療3.由于抗病毒藥物的耐藥以及治療的長(zhǎng)期性，在治療過(guò)程中應(yīng)該定期檢查，或是在發(fā)現(xiàn)藥物治療效果不佳時(shí)需排

14、除產(chǎn)生耐 藥的可能28檢測(cè)檢測(cè)檢測(cè)檢測(cè)29+目前檢測(cè)的變異位點(diǎn)： P區(qū)耐藥位點(diǎn)11個(gè)（169、173、180、181、184、194、202、204、 233、236、250）+專門(mén)檢測(cè)LAM變異位點(diǎn)：180，181，204，173+專門(mén)檢測(cè)ADV變異位點(diǎn)：181，233，23630艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心P P區(qū)基因變異檢驗(yàn)報(bào)告單區(qū)基因變異檢驗(yàn)報(bào)告單樣張樣張 31l傳播途徑傳播途徑: :主要血液主要血液/ /體液傳播體液傳播( (似似HBV)HBV)l是引起輸血后慢性肝炎和肝硬化主要原因是引起輸血后慢性肝炎和肝硬化主要原因l無(wú)癥狀無(wú)癥狀HCVHCV攜帶者和慢性丙肝者多見(jiàn)攜帶者和慢

15、性丙肝者多見(jiàn)l感染感染HCVHCV后，慢性化的比例高達(dá)后，慢性化的比例高達(dá)50%50%以上以上l免疫力不牢固免疫力不牢固黃病毒科黃病毒科 丙型肝炎病毒屬丙型肝炎病毒屬球形有包膜的球形有包膜的RNARNA病毒，直徑病毒，直徑50nm50nm病毒基因?yàn)閱喂烧湶《净驗(yàn)閱喂烧淩NARNA，鏈全，鏈全 長(zhǎng)約長(zhǎng)約10Kb10Kb32 HCV RNA HCV RNA 檢測(cè)檢測(cè) 確定引起病毒性肝炎的直接原因 通過(guò)病毒數(shù)量變化來(lái)監(jiān)測(cè)治療效果33實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)熒光PCRPCR法：法：檢測(cè)三個(gè)基因型（檢測(cè)三個(gè)基因型（1 1型、型、2 2型、型、3 3型）型）PCRPCR產(chǎn)物直接測(cè)序法：產(chǎn)物直接測(cè)序法：1-61-

16、6型及亞型型及亞型1a,1b,1c,2a,2b,2c,2i,2k,3a,3b,4a,5a,6a,1a,1b,1c,2a,2b,2c,2i,2k,3a,3b,4a,5a,6a,6b,6k6b,6kHCVHCV基因分型基因分型34 肝 炎肝 炎 分 子 診 斷 綜 合 檢 查 申 請(qǐng) 單分 子 診 斷 綜 合 檢 查 申 請(qǐng) 單 姓名 必填 性別（必填） 男 / 女 年齡 必填 門(mén)診號(hào) 科別 住院號(hào) 病房 床號(hào) 送檢醫(yī)院 送檢醫(yī)生 必填 醫(yī)生聯(lián)系電話 必填 采集時(shí)間（必填） 年 月 日 時(shí) 送檢時(shí)間（必填） 年 月 日 時(shí) 臨床印象：臨床印象： 乙肝 丙肝 混合性肝炎 肝硬化 肝癌 肝纖維化 現(xiàn)病

17、史現(xiàn)病史（臨床表現(xiàn)以及病程） 抗病毒藥物使用情況： 拉米夫定(賀普丁)_ 年 月至_ 年 月 阿德福韋(賀維力)_ 年 月至_ 年 月 恩替卡韋_ 年 月至_ 年 月 替比夫定_ 年 月至_ 年 月 替諾福韋_年 月至_ 年 月 干擾素_ 年 月至_ 年 月 恩曲他濱_年 月至_ 年 月 檢測(cè)項(xiàng)目（注意：請(qǐng)?jiān)谝獧z測(cè)的項(xiàng)目前打“檢測(cè)項(xiàng)目（注意：請(qǐng)?jiān)谝獧z測(cè)的項(xiàng)目前打“”確認(rèn)”確認(rèn) ） 核苷類似藥藥物敏感性核苷類似藥藥物敏感性 HBV P 區(qū)耐藥檢測(cè) 拉米夫定耐藥檢測(cè) 阿德福韋酯耐藥檢測(cè) e e 抗原陰性抗原陰性 HBV 前 C 區(qū)和 C 區(qū)變異檢測(cè) HBV 前 C 區(qū) 1896 位點(diǎn)檢測(cè)(熒光定量

18、 PCR 法) HBVC 區(qū) 1762/1764 位點(diǎn)檢測(cè)(熒光定量 PCR 法) 預(yù)后及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)預(yù)后及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) 高靈敏度 HBV-DNA（羅氏羅氏 COBASCOBAS：最低檢測(cè)下限最低檢測(cè)下限 12 12 IUIU，EDTAEDTA 抗凝血漿抗凝血漿 2ml2ml，適用于常規(guī)乙肝定量陰性的患者） HBV 基因分型(測(cè)序法：8 個(gè)基因型) HBV 基因分型(熒光 PCR 法：2 個(gè)基因型) HBV 前 S 區(qū)和 S 區(qū)變異檢測(cè) HCV 基因分型(測(cè)序法：6 個(gè)基因型及其亞型) HCV 基因分型(熒光 PCR 法：1a、1b、2a、2b、2c、3a) 其他肝炎病毒核酸檢測(cè)(熒光定量 PCR 法) 標(biāo)本類型標(biāo)本類型（必填）（必填） 血清 EDTA 抗凝血漿（紫頭管） 糞便（HAV、HEV 核酸檢測(cè)） 備注備注 1、采集血清(漿)量 2ml，抗凝血標(biāo)本請(qǐng)將血漿分離后送檢，