紅曲菌株的RAPD多態(tài)性分析

1、紅曲菌株的RAPD多態(tài)性分析丁紅梅葛爾寧王澤時【摘要】目的研究紅曲分離株的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為種質(zhì)鑒定、愛惜和利用提供參考。方式用隨機引物對io個紅曲菌株進行RAPD分析，從中挑選出63特點性好，多態(tài)性高的RAPD圖譜,用NTSYSPC軟件進行同一性和不同性分析并依照遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果紅曲分離株間的同一性平均,說明它們的遺傳背景具有專門大的相似性；RAPD聚類結(jié)果與菌株的形態(tài)不同相關(guān)，說明RAPD分子標記進行菌株辨別與傳統(tǒng)形態(tài)分類辨別結(jié)果大體一致，辨別能力較強。結(jié)論基于RAPD多態(tài)性的遺傳分析能從分子水平上揭露紅曲菌的遺傳背景不同，為分類鑒定、種質(zhì)起源和系統(tǒng)進化提供輔助手腕和技術(shù)

2、依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】紅曲菌；RAPD分析；遺傳同一性；系統(tǒng)進化樹Abstract：ObjectiveTostudythegeneticdiversityandrelativerelationshipofdifferentMonascustrainstoprovidereferenceforclassificationandprotectionofgermplasmresources.MethodsComparingtheresultsoftherandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)fingerprintsderivedfrom10cultivatedstrainso

3、fMonascus,63RAPDelectrophoresisatlaseswereselectedtocalculatethegeneticidentityanddivergenceamongthembyXTSYSPCthenphylogenetictreeofMonascusstrainswasconceivedaccordingtotheirgeneticdistancebyclusteringmethod.ResultsItwassuggestedthatthecomparabilityofgeneticbackgroundswasplentybecauseof%averageiden

4、tityofMonascusresultsofRAPDanalysiswereconsistentwiththatofmorphologicstudy,sotheRAPDmolecularmarkertechnologyisaneffectivewaytoidentifyMonascusstrains.ConclusionRAPDanalysiscanrevealthedifferentiaofgeneticbackgroundsofMonascusstrains,anditcouldbeappliedwidelyinclassificationandidentification,germpl

5、asmoriginandevolution.Keywords:Monascus;RAPDanalysis;geneticidentity;phylogenetictree紅曲是一味在本草綱目、醫(yī)林纂要等都有記載的天然佳品。長期以來，對紅曲菌分類鑒定均依照其形態(tài)特點和生理學(xué)特性14。由于紅曲菌屬下分類的形態(tài)、生化指標均受培育基質(zhì)、溫度等環(huán)境條件阻礙，表現(xiàn)出較大不同性，加上有些種界限不明確，使紅曲菌的命名和分類在學(xué)術(shù)上頗多爭議5。DNA分子在物種辨別分類和挑選上比形態(tài)學(xué)、血清學(xué)、化學(xué)指紋圖譜等更準確，目前已有限制性酶酶切片段長度多態(tài)性(RFLP),隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD),串聯(lián)重復(fù)序列(SS

6、R)等6直接在DNA水平上進行遺傳分析的實驗方式。由于紅曲菌的分子生物學(xué)研究起步較晚，基因組序列相關(guān)信息尚不清楚，限制了常規(guī)分子生物學(xué)方式的利用。RAPD標記技術(shù)不需要預(yù)先明白DNA序列信息，對DA質(zhì)與量要求不高，引物無種屬界限7等優(yōu)勢使其成為研究紅曲菌株辨別、遺傳分析的首選。1材料和方式實驗材料供試菌株及培育基：供試紅曲菌株編號110依次為AS、AS、B、F、J、M二、P、S、ZW五、古田，其中F為Monascusruber,余為Monascusanka.oB、F、J、P、S由浙江中醫(yī)藥大學(xué)腫瘤研究室保留，AS、AS、M二、ZW五、古田購自浙江省微生物研究所，ASAS為中國一般微生物菌種保藏

7、中心保留菌株。MEA(maltextractagar)6培育基。要緊試劑及隨機引物:要緊分子生物學(xué)試劑購自杭州博日科技及寶生物工程（大連）,RAPD分析所用10堿基隨機引物S251S350、S2001S2050購自上海生工生物技術(shù)公司，編號及核甘酸序列見上海生工生物技術(shù)公司網(wǎng)頁。實驗方式紅曲基因組DXA的提?。杭t曲菌體基因組DNA的提取采納CTAB法8進行。RAPD反映體系：RAPD反映體系為1XPCRBufer,dNTPslmmol/L,Taq酶，隨機引物Umol/L,模板DNA20ng,反映整體積為20uLoRAPD反映參數(shù)：擴增反映在梯度PCR擴增儀上進行，94預(yù)變性6min,進入92變

8、性40s、36退火40s、72延伸2min的35個循環(huán)，最后72補平7min,4終止反映。RAPD多態(tài)性分析：依照片段大小排列并記錄，條帶有計為“1”；條帶無計為“0”，構(gòu)建原始數(shù)據(jù)01矩陣，用NTSYSPC軟件計算出同一性和不同性,并用clustering中的UPGMA聚類方式構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；用Editfile生成遺傳同一性和不同性表。2結(jié)果2.1紅曲菌的RAPD電泳圖譜：用150條隨機引物擴增10株紅曲菌基因組DA,挑選出條帶多，特點性好，多態(tài)性高的63個電泳圖譜作為RAPD分析依據(jù)。不同紅曲分離株RAPD擴增產(chǎn)物有39條帶，多集中在3001500bp,其中主條帶24條，次帶豐碩，各菌株間

9、既有相同條帶又有不同條帶，如圖1。RAPD多態(tài)性分析：從選出的63個RAPD圖譜發(fā)覺，10株紅曲菌指紋圖譜條帶大體一致，說明其遺傳背景有專門大相似性，但個別譜帶之間存在不同程度不同，說明不同紅曲分離株間又有豐碩的遺傳多樣性。統(tǒng)計記錄電泳結(jié)果，取得344條電泳條帶的01矩陣。用NTSYSPC計算10株紅曲分離株遺傳同一性和遺傳不同性見表1,紅曲分離株間同一性為%，平均。聚類分析結(jié)果見圖2,其中與B、S與ZW-5的親緣關(guān)系較近，尤其是與古田同一性高達,遺傳距離超級接近，它們可能有一起先人。F處于相對獨立的一支，與其它紅曲菌親緣關(guān)系均較遠。圖1引物S2042在10個紅曲菌株中的RAPD擴增結(jié)果（略）

10、M：Marker；1：AS；2：AS；3：B；4：F；5：J；6：M-2；7：P；8：S；9：ZW-5；10：古田圖2紅曲分離株的系統(tǒng)聚類進化樹（略）表1紅曲分離株的同源性（左下）和不同性（右上）（略）3討論本研究顯示盡管10株紅曲菌來源各異，但同一性平均高達,說明其遺傳背景有專門大相似性，這與邢旺興等9的結(jié)果一致。結(jié)合形態(tài)學(xué)特點發(fā)覺RAPD遺傳分析結(jié)果與菌株間的形態(tài)不同相關(guān)，如:RAPD多態(tài)性提示F與其它紅曲菌同一性僅有40%左右，多態(tài)性較高，極可能與種間不同有關(guān)，菌落形態(tài)和顯微鏡檢說明F屬種而AS、B等那么屬種。這說明RAPD指紋圖譜能較好地反映紅曲菌株間的遺傳關(guān)系，辨別能力較強。均分離自

11、福建的和古田有地理距離優(yōu)先聚類偏向，同一性高達,遺傳距離超級近，說明地緣關(guān)系也是系統(tǒng)分類、遺傳進化重要阻礙因子。本研究利用分子生物學(xué)和數(shù)值分類方式研究紅曲菌種質(zhì)資源，從分子水平揭露紅曲菌遺傳背景不同，其結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果大體一致，說明RAPD分析具有較強菌株辨別能力，不僅可作為一種輔助辨別工具提高鑒定的準確性和客觀性，而且為進一步研究紅曲種質(zhì)起源和進化提供參考?！緟⒖嘉墨I】1XingWangxing,ChengRongzhen,MiHeming,etal.StudyonthephysiologicalcharacteristicsofsevenordinaryMonascusJ.TheJour

12、nalofPharmaceuticalPractice,2001,19(4):231233.2邢旺興.中藥紅曲基原真菌的高效毛細管電泳色譜法辨別J.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000,21(1)：5961.3邢旺興，陳士景，宓鶴鳴，等.中藥紅曲的薄層色譜法辨別J.藥學(xué)實踐雜志，2000,18(2):9395.4邢旺興，宓鶴鳴，陳斌，等.氣相色譜-模糊聚類分析法用于紅曲基原菌的辨別J.中國中藥雜志，2000,25(6)：329334.5李鐘慶，郭芳.紅曲菌的形態(tài)與分類學(xué)M.北京:中國輕工業(yè)出版社，2003.6吳學(xué)謙，李海波，魏海龍，等.DNA分子標記技術(shù)在食用菌研究中的應(yīng)用及進展J.浙江林業(yè)科技，2004,24(2)：7580.7WeilliamsJGK,Kubelikpolymorphi