液體菌種的制作及使用方法

1、液體菌種的制作及使用方法發(fā)布時(shí)間：2009-05-21 閱讀: 1215次打印文章 關(guān)閉窗口液體菌種的制作及使用方法隨著食用菌生產(chǎn)的發(fā)展,食用菌制種方法在傳統(tǒng)固體制作的基礎(chǔ)上在不斷的改進(jìn)和提高,其中液體菌種的制作便是其中之一。 液體發(fā)酵技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)之一，起源于美國(guó)。它是指在生化反應(yīng)器中，模仿自然界將食藥用菌在生育過程中所必需的糖類、有機(jī)和無機(jī)含有氮素的化合物、無機(jī)鹽等一些微量元素以及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶解在水中作為培養(yǎng)基，滅菌后接入菌種，通入無菌空氣并加以攪拌，提供食用菌菌體呼吸代謝所需要的氧氣，并控制適宜的外界條件，進(jìn)行菌絲大量培養(yǎng)繁殖的過程。工業(yè)化大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)即為發(fā)酵生產(chǎn)，亦稱深層培養(yǎng)

2、或沉沒培養(yǎng)。液體菌種由于具有生產(chǎn)規(guī)模化、控制自動(dòng)化、生長(zhǎng)無菌化、發(fā)菌高速化的生產(chǎn)應(yīng)用優(yōu)勢(shì),為食用菌產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展提供了良好的種源條件,是食用菌產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的必然方向,已被業(yè)內(nèi)人士所看好。液體菌種是用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)而成的菌種。近年來，國(guó)內(nèi)外正積極研究液體菌種的培養(yǎng)與利用。與固體菌種相比，它具有菌種生產(chǎn)周期短、菌齡整齊一致、接種方便、接于固體菌料發(fā)酵快、適宜于工廠化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因而受到了廣大栽培者的歡迎。目前我國(guó)已能進(jìn)行深層發(fā)酵的食用菌有：香菇、平菇、鳳尾菇、美味側(cè)耳、鮑魚菇、金針菇、黑木耳、猴頭、草菇、蜜環(huán)菌、茯苓、滑菇和冬蟲夏草等。一、液體菌種的培養(yǎng)方法常見的有采用搖床來生產(chǎn)的搖瓶培養(yǎng)法和采用發(fā)酵

3、罐來生產(chǎn)的深層培養(yǎng)法。若少量生產(chǎn)，可以用搖瓶培養(yǎng)法。深層培養(yǎng)需要一整套工業(yè)發(fā)酵設(shè)備，如鍋爐、空氣壓縮機(jī)、空氣凈化系統(tǒng)、發(fā)酵罐等，故投資大，只適用于工廠化的大規(guī)模生產(chǎn)。而搖瓶培養(yǎng)投資少，設(shè)備技術(shù)簡(jiǎn)單，適合一般菌種廠生產(chǎn)使用。本節(jié)主要介紹搖瓶培養(yǎng)的技術(shù)方法。1、食用菌液體發(fā)酵的培養(yǎng)基根據(jù)培養(yǎng)基中組成的不同，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基的組成均為天然有機(jī)物。合成培養(yǎng)基則是采用些已知化學(xué)成分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作培養(yǎng)基。在生產(chǎn)上，還根據(jù)工藝將培養(yǎng)基分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基。但無論如何劃分，每一種培養(yǎng)基的組成中都離不開碳、氮、無機(jī)鹽、微量元素、維生素和生長(zhǎng)素等。 1.1、碳、氮比(C/N

4、)碳、氮比指碳源及氮源在培養(yǎng)基中的含量比。構(gòu)成菌絲細(xì)胞的碳、氮比通常是：812:1。由于菌絲生長(zhǎng)過程中，一般需50%的碳源作為能量供給菌絲呼吸，另50%的碳源組成菌體細(xì)胞。因此培養(yǎng)基中理想碳、氮比的理論值為1624:1。在液體培養(yǎng)中以菌絲增殖為目的的培養(yǎng)，通常碳、氮比以20:1為宜。雖然食用真菌的液體培養(yǎng)一般要求較高的碳與氮比，即C:N20:1左右生長(zhǎng)較好，但許多菌種也能在較寬的碳、氮比范圍內(nèi)生長(zhǎng)。不同的菌種所要求合適的碳、氮比，可通過實(shí)驗(yàn)求得。 1.2、無機(jī)鹽與微量元素許多無機(jī)鹽及微量元素對(duì)菌種的生理過程的影響與其濃度有關(guān)。不同的菌種，對(duì)無機(jī)鹽及微量元素要求的最適濃度也不同。 1.2.1磷

5、磷是細(xì)胞中核酸、核蛋白等重要物質(zhì)的組成部分，又是許多輔酶(或輔基)高能磷酸鍵的組成部分。磷是食用菌液體發(fā)酵不可缺少的物質(zhì)，常加入磷酸二氫鉀以提供磷，加入量大約為0.1%0.15%。1.2.2鎂 鎂在細(xì)胞中起著穩(wěn)定核蛋白、細(xì)胞膜和核酸的作用，而且是些重要酶的活化劑，是食用真菌液體培養(yǎng)中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分。一般通過加入硫酸鎂以提供鎂，濃度通常是0.05%0.075%。1.2.3鉀、鈣、鈉 鉀不參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的構(gòu)成，但控制原生質(zhì)的膠態(tài)和細(xì)腦膜的透性。鈣離子與細(xì)胞透性有關(guān)。鈉離子能維持細(xì)胞滲透壓，鈉離子可以部分代替鉀離子的作用。三種物質(zhì)需求量甚微，若采用天然培養(yǎng)基，可不必另加。1.2.4硫、鐵 硫是

6、菌體細(xì)胞蛋白質(zhì)的組成部分(胱氨酸、半胱氨酸及蛋氨酸中皆含硫)，鐵是細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過氧化氫酶的組成部分，亦是菌體有氧代謝中不可缺少的元素。1.2.5鋅、錳、鈷、銅 鋅、錳、鈷等離子是某些酶的輔基或激活劑。銅是多元酚氧化酶的活性基。在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意，鎂和磷的添加不宜過多，否則會(huì)帶來危害。菌體對(duì)鋅、錳、鈷、銅等微量元素的需求量甚少，一般天然有機(jī)原料中均有，不必另加。碳酸鈣本身不溶于水，但可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)其中的酸堿度。磷酸鹽與碳酸鈣不宜混合滅菌，否則會(huì)形成不溶于水的磷酸鹽，使可溶性的磷酸鹽濃度大大降低。 1.3、維生素維生素在細(xì)胞中作為輔酶的成分，具有催化功能。大多數(shù)食用真菌的培養(yǎng)都與B族

7、維生素有關(guān)，維生素B1是目前已知對(duì)絕大多數(shù)食用真菌生長(zhǎng)有利的維生素。其適宜濃度在501000g/L之間。 2、搖瓶振蕩培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)液配制好后，裝入500mL容量的三角燒瓶中，每瓶裝量為100mL，并加入015粒小玻璃珠，加棉塞后再包扎牛皮紙封口，在1.5kg/cm2壓力下滅菌30分鐘，取出冷卻到30以下時(shí)，接入一塊約2平方厘米的斜面菌種，于2325下靜置培養(yǎng)48小時(shí)，再置往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)，振蕩頻率為80100次/分，振幅6cm10cm。如果用旋轉(zhuǎn)式搖床，振蕩頻率為200220轉(zhuǎn)分。搖床室溫控制在2425，培養(yǎng)時(shí)間因菌類不同而異，一般是在7天左右。培養(yǎng)結(jié)束的標(biāo)準(zhǔn)是：培養(yǎng)液清澈透明，液中懸浮著

8、大量小菌絲球，并伴有各種菇類特有的香味。二、液體菌種的檢驗(yàn)方法對(duì)液體菌種進(jìn)行檢驗(yàn)可采用感官檢查和取樣測(cè)驗(yàn)相結(jié)合的方法。2.1. 感官檢查 可采用“看、旋、嗅”的步驟進(jìn)行檢查。看：將樣品靜置桌上觀察。一看菌液顏色和透明度，正常發(fā)酵醪液呈黃色或黃褐色，清澈透明，菌絲顏色因菌種而異，老化后顏色變深；染雜菌的醪液則混濁不透明。二看菌絲形態(tài)和大小，正常的菌絲大小一致，呈球狀、片狀、絮狀或棒狀，菌絲粗壯，線條分明；而染雜菌后，菌絲纖細(xì)，輪廓不清。三看上清液與沉淀的比例，菌絲體占比例越大越好，較好的液體菌種，在瓶中所占比例可達(dá)80%左右。四看pH值指標(biāo)是否變色，在培養(yǎng)液中加入甲基紅或復(fù)合指標(biāo)劑，經(jīng)35天顏色

9、改變，說明培養(yǎng)液pH值到達(dá)4.0左右，為發(fā)酵點(diǎn)；如果在24小時(shí)內(nèi)即變色，說明因雜菌快速生長(zhǎng)而使培養(yǎng)液酸度劇變。五看有無酵母線，如果在培養(yǎng)液與空氣交界處的瓶壁上有灰色條狀附著物，說明為酵母菌污染所致，此稱為酵母線。旋：手提樣品瓶輕輕旋轉(zhuǎn)一下，觀其菌絲體的特點(diǎn)。醪液的粘稠度高，說明菌種性能好；稀薄者表明菌球少，不宜使用。菌絲的懸浮力好，放置5分鐘不沉淀，表明菌種生長(zhǎng)力強(qiáng)；反之，如果菌絲極易沉淀，說明菌絲已老化或死亡。再次觀其菌絲狀態(tài)，大小不一，毛刺明顯，表明是供氧不足；如果菌球縮小且光滑，或菌絲纖細(xì)并有自溶現(xiàn)象，說明污染了雜菌。嗅：在旋轉(zhuǎn)樣品后，打開瓶蓋嗅氣味。培養(yǎng)好的優(yōu)質(zhì)液體菌種，均具有芳香氣味

10、；而染雜菌的培養(yǎng)液則散發(fā)出酸、甜、霉、臭等各種異味。2.2. 取樣測(cè)驗(yàn) 可取液體菌種進(jìn)行稱重檢查和粘度檢查；生長(zhǎng)力測(cè)定和出菇試驗(yàn)；化學(xué)檢查，包括測(cè)pH值、糖含量和氧含量等；顯微檢查，包括細(xì)胞分裂狀態(tài)觀察、普通染色和特殊染色等。三、液體菌種的使用方法液體菌種可作原種使用，也可作栽培使用。3.1. 作原種 取一支100ml。獸用注射器，去掉針尖，換一根內(nèi)徑1mm2mm，長(zhǎng)100mm120mm的不銹鋼鋼管，制成一個(gè)菌種接種器。使用前，洗凈接種器并用紗布包好，經(jīng)高壓蒸汽滅菌，冷卻后抽取液體菌種即可進(jìn)行接種。經(jīng)滅菌待接入菌種的原種瓶，先要在無菌條件下去掉棉塞，并改換無菌薄膜包扎瓶口。接種時(shí)，將針管插入瓶

11、口上的薄膜，每瓶接種量為10mL5ml，要注意使液體菌種均勻分布在培養(yǎng)基表面，拔出針管后要立即用膠布貼封針孔，豎放在培養(yǎng)室的床架上進(jìn)行培養(yǎng)。3.2. 作栽培種或直接進(jìn)行栽培 液體菌種在作栽培使用時(shí)，瓶栽的每瓶接種量為10mL15mL；熟料袋栽的每袋接種量為，小袋10mL15mL，大袋的20mL30mL；開放式床栽的，每平方米接種量為500mL1000mL，不需要接種針筒，可直接均勻?yàn)⒃谂囵B(yǎng)料面，或進(jìn)行穴播。在無菌的條件下把菌種投放到培養(yǎng)基里。安裝通氣管后用輸氧機(jī)給培養(yǎng)基輸入氧氣。把培養(yǎng)基放置在搖床機(jī)上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。食用菌液體菌種具有生產(chǎn)周期短、菌齡整齊一致、接種方便、發(fā)酵快、適宜于工廠化生產(chǎn)等

12、優(yōu)點(diǎn)。食用菌液體菌種的生產(chǎn)方式一般可分為電磁攪拌法、搖瓶機(jī)法、簡(jiǎn)易深層發(fā)酵（吹氧）法、發(fā)酵罐法。據(jù)省農(nóng)科院食用菌站工作人員介紹，搖瓶機(jī)法不僅接種簡(jiǎn)單，管理方便，而且生產(chǎn)量根據(jù)機(jī)器的設(shè)定而不同，投資20003000元即可。配制液體培養(yǎng)基 先把馬鈴薯煮到熟而不爛時(shí)提取上清液，然后配制3%葡萄糖、1%玉米粉、0.05%硫酸鎂、0.1%磷酸二氫鉀，最后將馬鈴薯上清液和上述溶液及水混合即可。液體培養(yǎng)基適用于多種食用菌菌種的培養(yǎng)。搖瓶振蕩培養(yǎng) 液體培養(yǎng)基配制好后，裝入容量為500毫升的三角燒瓶中，每瓶裝入100毫升，并加入115粒小玻璃珠，瓶口用棉塞、牛皮紙密封，在1.5千克/平方厘米壓強(qiáng)下滅菌30分鐘。然后投入一塊約2平方厘米的斜面菌種，于2325下靜置培養(yǎng)24小