鯉魚腦乙酰膽堿脂酶的活性測定

1、 北京科技大學必修課程實驗研究論文題目:課程:班級:作者:學號:鯉魚腦乙酰膽堿脂酶的活性測定生物化學實驗黃凱輝41467024化生學院生技1401鯉魚腦乙酰膽堿酯酶(AChE的活性測定黃凱輝摘要 建立了以新鮮豬心為材料,經(jīng)過酸溶液提取,人造沸石吸附,硫酸銨溶液洗脫和三氯乙酸沉淀等步驟快速制備細胞色素C的方法,進而考察了制備蛋白質制品的一般原理和操作技術。測定細胞色素C 含量時,其520nm處吸光度的標準曲線為:y = 0.7762x + 0.05,R² = 0.9974;將細胞色素C粗品溶液稀釋適當倍數(shù),加入少許聯(lián)二亞硫酸鈉后,在520nm下測其吸光度A=0.210。樣品原液濃度C=

2、1.072 mg/mL;每500g心肌碎肉含細胞色素C=64.0 mg。關鍵詞 細胞色素C 分離純化分光光度法1 引言經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟系統(tǒng)疾病、重癥肌無力、有機磷中毒等的重AChE可溶于水或稀鹽溶液,因而可將生物組織及緩沖溶液置于組織勻漿器或組織搗碎機中制備組織勻漿,經(jīng)離心后,其上清部分可用于測定組織中AChE的活性。AChE的活性定方法主要有光學方法和電化學方法。本實驗采用分光光度法測定AChE活性。其基本原是乙酰膽堿酯酶催化碘化硫代乙酰膽堿水解,其生成物碘化硫代膽堿與巰基顯色劑5,5-二硫代-雙(2-硝基苯甲酸(DTNB反應,生成黃色產(chǎn)物5-巰基-2-硝基苯甲酸(5-TNBA,反應方程式如

3、下圖所示。本實驗通過測定酶促反應初速度的方法計算酶活性。方法是酶促反應開始后每30s測定次吸光度,連續(xù)測定3min。計算吸光度變化的平均值A/min。根據(jù)波爾定律:A=CL,每分鐘產(chǎn)物濃度的變化值C=A/L。已知5-TNBA的值為1.96×105 L/molcm,比色杯的光程長1 cm,因此,C(mol/L =A/(1.96×105。根據(jù)酶活性單位的定義:25 ,最適pH值和最適底物濃度下,酶分鐘催化1mol底物所需的酶量為1 IU,酶活性=C×106 IU。酶的比活=酶活性/總蛋白濃度。2 實驗部分2.1 試劑和儀器活鯉魚。硫代-雙(2-硝基苯甲酸5 mmol/

4、L 碘化硫代乙酰膽堿100 mmol/L5,5-二Tris-HCl緩沖溶液(pH7.4,20mmol/L,含0.1% Triton X-100和0.05mol/L NaCl磷酸鹽緩沖液(pH7.4,20mmol/L考馬斯亮藍G-250試劑冷凍高速離心機,分光光度計,組織勻漿器。2. 2 乙酰膽堿脂酶的制備取1條活鯉魚,剪開頭骨,再用鑷子將整個腦組織取出,以濾紙吸去血絲,并除去非腦組織,放入表面皿中稱重。然后用含0.1% Triton X-100和0.05mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.4,20mmol/L 冰浴條件下勻漿,勻漿比(質量體積比為1:4制成勻漿液。在4 離心

5、(10000r/min30min,得離心上清液,即為粗酶提取液,記錄體積并在4下保存。參照Bradford(1976考馬斯亮藍G-250法。用牛血清白蛋白(BSA作為標準,繪制標準曲線。取1ml待測酶液(調(diào)整蛋白質含量20-100g,加5ml考馬斯亮藍G-250染色液,混合均勻后30min 內(nèi)測OD值。由標準曲線計算酶液中蛋白質的含量。取3m1磷酸緩沖溶液和50l酶提取液加入10ml試管內(nèi),于35保溫10min。依次加入20l碘化硫代乙酰膽堿(100mmol/L,20l DTNB溶液(5mmol/L,混合均勻。在波長412nm處用1cm比色皿比色。測定時每隔30s讀數(shù),連續(xù)測定3min。3 數(shù)

6、據(jù)記錄3.1標準溶液的配置標準蛋白溶液的配制:精確稱取牛血清白蛋白500mg,用蒸餾水定容至50mL,配成10.mg/mol的溶液1。取1ml溶液1,用去離子水定容至10ml,配成1.00mg/ml的標準蛋白溶液?？捡R斯亮藍G-250溶液的配制:精確稱取考馬斯亮藍G-250100mg,溶于50mL95%的乙醇,再加入120mL85%的磷酸,稀釋定容至1000mL備用。3.2 未知樣品中蛋白質吸光度值的測定實驗中加入50ul碘化硫代乙酰膽堿,以確保使乙酰膽堿脂酶一直能發(fā)揮最大酶活,在各個時間點讀數(shù)如下:時間點0S30S60S90S120S150S180S3.3標準曲線的確定在試管中分別精確移取牛

7、血清蛋白標準溶液0、70、80、90、100、110、120uL,加蒸餾水至1.0mL,然后在各支試管中分別加入4.0mL考馬斯亮藍G-250溶液,搖勻。 在595nm波長處測定吸光度 4數(shù)據(jù)處理4.1標準曲線的建立以牛血清白蛋白標準溶液濃度為橫坐標,以吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。 回歸方程為Y=30.779X- 0.0094 (R2=0.9989。4.2酶活測定建立吸光度-時間曲線 回歸方程為y=0.001564x+0.0355 (R2=0.99944.3酶活計算由吸光度-時間曲線可知每秒吸光度變化0.001564,由蛋白質濃度-吸光度標準曲線可知,每秒蛋白質濃度增加3.562x104結論:本實驗測得魚腦中乙酰膽堿脂酶活為3.562x1045.注意事項1 實驗材料應盡