DNA電化學生物傳感器的原理與研究進展

1、第29卷第1期2009年3月CHEMICAL化學傳感器SENSORSVol29, No1Mar 2009DNA 電化學生物傳感器的原理與研究進展毛斌，韓根亮，馬莉萍，劉斌，高曉平，李工農，劉國漢（甘肅省科學院傳感技術研究所，甘肅蘭州730000）摘要：DNA 電化學生物傳感器是近年迅速發(fā)展起來的一種全新的生物傳感器，該類傳感器具有電極制作簡便、使用壽命長、重現(xiàn)性好、靈敏度高、成本低、易于實現(xiàn)微型化等諸多優(yōu)點，在臨床醫(yī)學檢驗、遺傳工程、藥物作用機理、新藥篩選、環(huán)境監(jiān)測和食品工程等領域已得到廣泛地研究與應用。該文簡單介紹了DNA 電化學生物傳感器的基本原理，對其研究進展加以分類和簡要評述，最后對其

2、發(fā)展方向進行了展望。關鍵詞：DNA 電化學生物傳感器；基本原理；研究進展Fundamentals and progresses of DNA electrochemical biosensorMao Bin , Han Gen-liang , Ma Li-ping , Liu Bin , Gao Xiao-ping , Li Gong-nong , Liu Guo-han(Institute of Sensor Technology , Gansu Academy of Sciences , Lanzhou 730000，ChinaAbstract ：DNA electrochemical b

3、iosensor, which has been developed rapidly in recent years, is one new type of biosensorsThis kind of biosensors has superiority in electrode fabrication, durable years, reproduction quality, testing sensitivity, production cost and micromation realizationSo they are of significant progress in resea

4、rch and application, such as clinical medical analysis, genetic engineering, mechanism of drug action, new drug selection, environmental monitoring and food engineeringThe fundamentals of DNA electrochemical biosensor is introduced, the progresses of the biosensor are assorted and appraised briefly

5、and its development trends is discussed in this articleKey words ：DNA electrochemical biosensor ；fundamentals ；progress0引言隨著人類基因組計劃（human genome project,分子作為敏感元件，制成用于DNA 快速測定1的傳感器，可與電化學技術、熒光技術2、表面等離子體共振技術3和石英晶體微天平技術4等其它檢測技術聯(lián)用，能極大地提高基因檢測速度。將電化學方法應用于DNA 生物傳感器是近年來發(fā)展非常迅速的一個研究領域5。生物大分子DNA 與電化學轉換器（電流型或電位型

6、的電極）組合即可構成DNA 電化學生物傳感器。此類傳感器具有電極制作簡便、使用壽命長、重復性好、靈敏度高、成本低、能耗少、易攜帶、不破壞測試樣品、不受溶液顏色影響、易于實現(xiàn)微型化等諸多優(yōu)點5。研究DNA 電化學生物傳感器技術對促進DNA 芯片技術發(fā)展也具有重要的指導意義6。目前利用電化學生物傳感器可以準確HGP ）的實施，為基因疾病的診治提供了科學依據，使得基因檢測在分子生物學和生物醫(yī)學研究中的重要性更突顯出來。同時，人體、病毒和細菌核酸中特定堿基序列的檢測在食品污染、法醫(yī)鑒定和環(huán)境監(jiān)測等領域已經開始發(fā)揮越來越重要的作用。大規(guī)模的基因分析要求使用更簡便、迅速、廉價和微型化的檢測裝置。隨著許多生

7、物新技術的出現(xiàn)，為開發(fā)高靈敏、高特異性的基因檢測方法注入了活力，其中利用DNA 雙鏈的堿基互補配對原則發(fā)展起來的各種DNA 生物傳感技術，受到生物分析工作者的高度重視。利用DNA基金項目：甘肅省科學事業(yè)費項目(QS001C3201）通訊聯(lián)系人，Tel：09318633673，Email：genlhanvipsinacom10化學傳感器29卷ssDNA 的固定dsDNA 的雜交雜交指示劑的嵌入電化學檢測 1期毛斌等：DNA 電化學生物傳感器的原理與研究進展11圖2共價鍵固定DNA 鏈的方法(a玻碳電極，(b碳糊電極，(c石墨電極，(d金電極，(e金電極，(f鉑電極，(g多種基底電極Fig2Cov

8、alentbindingMethods of DNA ligands Immobilization(a glass carbon electrode，(b carbon paste electrode，(c graphite electrode，(d Au electrode，(e Au electrode，(f Pt electrode，(g many kinds of basic electrode擇性地與dsDNA 結合，結合方式有：直接嵌入到DNA 片段的濃度。二茂鐵及其衍生物18、亞甲基藍等是常用的嵌入劑，一些金屬復合物也能成為dsDNA 雙螺旋的堿基之間，或通過靜電作用與DNA 骨

9、架上的磷酸基團間的結合。電化學活性標識劑與電極表面的dsDNA 結合后，電化學檢測到的信號大小或變化值可以反映電極表面DNA 雜交的指示劑，如鈷復合物19、銣復合物20和鋨復合物21。133利用無機納米粒子的放大功能間接檢測納米材料具有的特異性質，可作為將ssDNAdsDNA 的多少，從而間接測定被測溶液中靶12化學傳感器29卷固定到電極表面的基質，與其它電化學活性標識劑聯(lián)用，使檢測信號放大增強，從而間接檢測靶已證明PNA 與互補核苷酸的雜交特性，在很多方面顯示出優(yōu)于ssDNA 的性能，有望被很好地用于基因診斷。DNA 片段的濃度。研究者們已將納米金22、碳納米管2324、納米銀2527等納米

10、材料應用在該領域。其中納米金顆粒具有小尺寸效應、表面效應和量子尺寸效應等，呈現(xiàn)出奇異的光學和電學性質，同時它還具有良好的生物相容性，宜與DNA 分子結合。上述這些性質使它在電化學DNA 生物傳感器和基因芯片技術中得到廣泛應用，例如：功能化的納米金粒子、和其它金屬構成復合納米材料以及與磁性微粒2829相結合都是213DNA 損傷研究DNA 損傷物質的監(jiān)測屬于早期診斷和預防重大疾病的重要步驟之一。孫星炎等39以石墨電極為基底電極，研究了在不同致突變因素（包括紫外光照射、亞硝酸）的作用后，特定堿基序列的DNA 生物傳感器和基因芯片技術的研究方向與熱點。134利用酶分子的放大功能間接檢測酶聯(lián)放大反應的

11、電化學寡核苷酸實驗與早期基于酶標記的免疫測定相似。在DNA 分子上標記酶作為識別元素，酶與底物作用時，有電化學響應信號。靶基因標記酶后，使檢測電極與酶的底物作用，通過檢測電化學信號，就可以間接檢測靶DNA 。Kavanagh 等30將靶DNA 連上葡萄糖氧化酶，用修飾后的金電極間接檢測靶DNA 。在已有的報道中研究最廣泛的是過氧化酶3133，目前已實現(xiàn)商品化34。DNA 與電極表面的ssDNA 能否雜交及雜交程度，以此來探討DNA 突變情況及可能的突變機理。Wang 等40直接固定dsDNA ，制備出微型電化學傳感器，通過探討紫外光輻射引起的DNA 中鳥嘌呤氧化峰信號的變化，檢測DNA 的損傷

12、。214藥物檢驗DNA 傳感器在藥物分析中的應用也越來越受到關注。Brett 等41利用DNA 修飾電極建立了對抗癌藥卡鉑的測定方法；Ov ádekov á等人42利用DNA 修飾電極研究了黃連素對癌細胞基因的作用；K erman 等人43建立了一種新型的雜交檢測方法，有望用于制藥和臨床診斷；Gu 等人44研究了一種新型的碳糊電極可檢測抗早孕藥物米非司酮。2DNA 電化學生物傳感器的應用現(xiàn)狀將DNA 電化學生物傳感器在各個領域的研究進展簡要介紹如下：21在醫(yī)學上的應用211細菌及病毒感染類疾病診斷在傳統(tǒng)方法中，細菌及病毒感染類疾病是通過血液體外培養(yǎng)來診斷的，這需要幾天甚至幾

13、十天的時間，嚴重延誤了疾病診療。利用DNA 電化學生物傳感器可快速檢測細菌和病毒，Hashimoto 等35利用光刻微細加工技術刻蝕出03mm 的固定DNA 探針微金膜電極，應用于測定乙型肝炎病毒。22在環(huán)境監(jiān)測中的應用221環(huán)境有機物的監(jiān)測Wang 等45報道了測定肼類化合物的電化學DNA 傳感器，能靈敏測定水中的不同肼類化合物，檢測限為1×109g mL 。還研究了46用于芳香胺類化合物測定的DNA 傳感器，對芳香胺類化合物的檢測限可達到納摩爾數量級。Brett 等人47研究了DNA 電化學生物傳感器，可檢測三嗪衍生物引起的環(huán)境污染物。222環(huán)境病原微生物的監(jiān)測大腸桿菌（Ecol

14、i）是一種致病菌，常會引起腹瀉等疾病，Wang 等48利用絲網印刷轉換器，研制了測定環(huán)境中EcoliDNA 序列的電化學生物傳感器。212基因診斷223重金屬離子的監(jiān)測Millan 等36用ssDNA 修飾了碳糊電極，用該傳感器測定了18個堿基長度的囊性纖維變性基因序列。Wang 等37對腫瘤抑制基因p53進行檢測，取得滿意的結果。Wang 等38提出以肽核酸（PNA ）代替ssDNA 作為探針修飾到電極表面，DNA 和重金屬離子相互作用機理，是研究重金屬對DNA 產生毒效作用的關鍵，也是近年來活躍的前沿研究領域之一4950。干寧等人51利用DNA 電化學生物傳感器測定水中痕量鉛，檢測限為20

15、×108mol L 。1期毛斌等：DNA 電化學生物傳感器的原理與研究進展1323食品工業(yè)231轉基因食品的檢測杜曉燕等52將生物素標記的ssDNA 通過生物素親和素體系固載到鉑電極上，識別轉基因食品中的特異DNA 序列，該方法檢測靈敏度高。化學DNA 生物傳感器的研究將主要集中在以下幾個方面：1）優(yōu)化電極結構及ssDNA 的固定技術，例如發(fā)展自組裝修飾技術等，提高ssDNA 的固定效果；2）結合其它技術如納米技術等，獲得更高靈敏度的檢測；232食品新鮮程度的檢測文獻53報道上?？茖W家研制出新型DNA3）繼續(xù)深入研究其在臨床基因診斷、藥物篩選等方面的應用；電化學生物傳感器，能靈敏地檢

16、測細胞中的能量分子三磷酸腺苷（ATP ）的含量。人工合成的DNA 只要碰上ATP ，雙螺旋結構就會解鏈，導電性增強，因此只要測出電流的大小，就能知道ATP 的含量。該傳感器可用于快捷地檢測食品的新鮮程度。4）尋求其它技術與DNA 電化學生物傳感器的結合，拓展其研究應用領域；5）應用肽核酸（peptide nucleic acid, PNA ）取代ssDNA ，以提高傳感器的穩(wěn)定性；6）實現(xiàn)人工智能化、微型化、商品化，使此類傳感器滲透到人們的生活實踐中。24基因芯片基因芯片是將分子生物學技術與半導體工業(yè)的微型制造技術結合，把巨大數量的寡核苷酸、肽核酸或DNA 分子固定在一塊面積極小的基片（如：硅

17、片、玻片或尼龍膜等）上構成。經典的芯片檢測一般采用同位素或熒光染料為信號報告分子，但都存在一定的缺點，如：靈敏度低、特異性不高、操作復雜、耗時長、有污染、需避光、半衰期短、易淬滅及不易檢測等。從而長期制約著基因芯片的更為廣泛地應用和發(fā)展54。因此尋求一種更安全、更方便簡單、更靈敏特異的信號分子或檢測手段是芯片技術研究的難點和熱點。參考文獻1Cilkowski M L ，F(xiàn)anf M M, Lund M E JAsurface plasmonresonance method foe detecting multiple modes of DNAligand interactionwsJPharm

18、BiomedAnal ，2000，22（6）：103710452Pope L H ，Allen S ，Davies M C ，et alProbing DNADuplex Formation and DNA DrugInteractions by the Quartz Crystal Microbalance Technique JLangmuir，2001，17（26）：830083043Vercoutere W ，Akeson MBiosensors for DNA sequencedetectionJBiology，2002，6（6）：8168224Orpana A KFluoresce

19、nce resonance energy transfer(FRETusing ssDNA binding fluorescent dyeJBiomolEng,2004，21（2）：45505Wang JSurvey and summary from DNA biosensors togene chipsJNuclAcidsRes,2000，28（16）：301130166Mascini M ，Palchetti I ，Marrazza G ，et al DNA elec-trochemical biosensors JAnalChem,2001，369（1）：15227李家洲，劉耘，劉仲，等

20、DNA 傳感器應用研究進展J傳感器技術，2001，20（10）：138Brabec VDNAsensor for the determination of antitumorplatinum compoundsJElectrochemActa,2000，45：292929329王建龍DNA生物傳感器在環(huán)境污染監(jiān)測中的應用J生物化學與生物物理進展，2001，28（1）：12512810Pividori M I , Merkoci A , Alegret SElectrochemicalgenosensor design:immobilisation of oligonucleotides ont

21、o transducer surfaces and detection methods JDNA 電化學生物傳感器技術具有諸多優(yōu)點，其研究對完善DNA 芯片技術是有益嘗試。Devaraj 等人55設計了一種簡易而直接的固定寡核苷酸表面陣列的方法，他們將帶有乙烯基的寡核苷酸與金電極表面疊氮功能化的自組裝單分子層作用，得到高度有序、選擇性好的DNA 陣列。除了上述領域，DNA 電化學傳感器的研究應用范圍還在不斷拓寬，例如蔣曉華等人56研究了DNA過氧化聚吡咯生物復合膜傳感器，可用于檢測神經遞質。3展望電化學DNA 傳感器的研究工作開辟了電化學與分子生物學的新領域，為生命科學的研究提供了一種全新的方

22、法，在遺傳疾病診斷、病原微生物檢測、轉基因生物檢測等方面顯示了廣泛的應用前景。目前，尤其在國內還處于起步階段，電1期 毛斌等:DNA 電化學生物傳感器的原理與研究進展 15 36 Millan K M ,Mikkelsen S R.Voltammetric DNA Biosensor for Cystic Fibrosis Based on a Modified Carbon Paste Electrode J . Anal. Chem., 1994 ,66 (18 : 2 9432 948. 37 Wang J , Rivas G , Cai X M , et al. Detection o

23、f clinically relevant point mutations by a novel piezoelectric biosensor J . Biosens. Bioelectron ., 2006 , 21 (10 : 1 876 1 879. 38 Wang J. "PNA Biosensors for Nucleic Acid Detection " in PNA Protocols and Applications,(P. Nielsen, Ed. ,Horizon Scientific Press ,1999. 39 孫星炎,徐春,劉 盛 輝 ,等 .

24、DNA 電 化 學 傳 感 器 在 DNA 損 傷 研 究 中 的 應 用 J . 高 等 學 校 化 學 學 報 , 1998, 19 (9 :1 3931 396. 47 Brett A O ,Silva L D.A DNA -electrochemical biosensor for screening environmental damage caused by s-triazine derivatives J . Anal. Bioanal. Chem.,2002 ,373 (8 : 717723. 48 Wang J , Rivas G , Cai X H. Screen -pri

25、nted electrochemical hybridization biosensor for the detection of DNA sequence from the Escherichia coli.pathogen J . Electroanalysis ,1997 ,9 (5 :395398. 49 Wang J ,Cai X H ,Rivas G ,et al.DNA electrochemical biosensor for the detection of short DNA sequences related to the human immunodeficiency v

26、irus J . Anal. Chem.,1996 ,68 (15 :2 6292 634. 50 Wang J , Rivas G , Cai X H , et al. Sequence -specific electrochemical biosensing of M. tuberculosis DNA J . Anal. Chim. Acta.,1997 ,337 (1 :4148. 51 干 寧 ,王 志 穎 ,徐 偉 民 ,等 .DNA 電 化 學 生 物 傳 感 器 測 定 水 中 痕 量 鉛 J . 廣 東 微 量 元 素 科 學 ,2007 ,14 (1 : 40 Wang J

27、 , Musameh M , Lin Y. Solubilization of carbon nanotubes by nafion toward the preparation of amperometric biosensors J . J. Am. Chem. Soc.,2003 ,125 (9 : 2 4082 409. 41 Brett A M O ,Seqlano S H P ,Macedo T A ,et al. Electrochemical determination of carboplatin in serum using a DNAmodified glassy car

28、bon electrode J . Electroanalysis, 1996, 8 (11 :992995. 42 Ovádeková R ,Jantová S ,Leta觢iová S ,et al. Nanostructured electrochemical DNA biosensors for detection of the effect of berberine on DNA from cancer cells J . Anal. Bioanal. Chem. ,2006 ,386 :2 0552 062. 43 Kerman K ,Mor

29、ita Y ,Takamura Y ,et al. Anal.Bioanal. Chem.,2005 ,381 (6 :1 1141 121. 44 Gu K ,Zhu J ,Zhu Y, et al.Voltammetric determination of mifepristone at a DNA -modified carbon paste electrode J . Fresenius J. Anal. Chem.,2000 ,368 (8 :832835. 45 Wang J ,Chicharro M ,Rivas G ,et a1.Narasalah Dontha Percio A M Farias and Haruki Shirashi Anal J . Anal. Chem ,1996, 68 (13 :2 2512 254. 4