動物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)_第1頁
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文檔簡介

1、 實(shí)驗(yàn)時間實(shí)驗(yàn)內(nèi)容4月11日實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)用液的配制、除菌與分裝4月18日實(shí)驗(yàn)二 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)4月25日實(shí)驗(yàn)三 魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)(組織塊法)(1-5組)401實(shí)驗(yàn)四 染色體制備(6-10組)3015月2日實(shí)驗(yàn)三 魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)(組織塊法)(6-10組)401實(shí)驗(yàn)四 染色體制備(1-5組)3015月9日實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞的復(fù)蘇與凍存實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)用液的配制、除菌與分裝【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握常見培養(yǎng)用液的配制方法。2. 掌握常用的滅菌方法。3. 了解每種培養(yǎng)用液的作用?!緦?shí)驗(yàn)原理】 常用細(xì)胞培養(yǎng)用液包括磷酸鹽平衡鹽溶液(Phosphate Buffered Saline,PBS)、液體培養(yǎng)基、胰蛋白酶(

2、Trypsin)和EDTA溶液。PBS用于清洗細(xì)胞、配制胰蛋白酶和 EDTA。培養(yǎng)基含有細(xì)胞生長需要的各種營養(yǎng)元素,使用時通常還需填加血清和抗生素。魚類細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基常用種類是MEM 和L-15;用于動物的一般是DMEM和RPMI-1640。胰蛋白酶可將貼壁的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上消化下來,通常使用濃度為0.25%或0.125%。EDTA 用于清洗細(xì)胞表面,螯合Ca2+等二價離子,使細(xì)胞易于為胰蛋白酶消化。細(xì)胞培養(yǎng)用的試劑必需是無菌的,PBS和EDTA可以采用高壓滅菌,而培養(yǎng)基和胰蛋白酶溶液含生物活性物質(zhì),配制好后通過過濾除菌?!驹噭?、材料與儀器】試劑:NaCl,KCl,Na2HPO4,KH2PO

3、4,EDTA,胰蛋白酶,HEPES,碳酸氫鈉,鹽酸,MEM或PRMI-1640培養(yǎng)基干粉,GPS材料:三蒸水,蒸餾水瓶,藥匙,稱量紙,燒杯(250 mL、1000 mL),玻棒,精密pH試紙(6.8-8.0),容量瓶(250 mL、1000 mL),移液管(5 mL、10 mL),一次性注射器,一次性過濾器,普鑷,酒精燈,打火機(jī),醫(yī)用酒精,酒精噴壺,消毒紗布,已高壓滅菌試劑瓶(500 mL、250 mL、100 mL),記號筆,標(biāo)簽紙,橡膠手套,封口膜儀器:精密天平,高壓滅菌鍋,超凈工作臺,加液槍,4冰箱【實(shí)驗(yàn)分組】實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行,每組4人,每班20人,共分5組。配制PBS并高壓滅菌,配制胰蛋白

4、酶溶液并過濾除菌和分裝,配制EDTA溶液高壓滅菌并分裝,配制培養(yǎng)基,過濾除菌培養(yǎng)基并分裝。每個實(shí)驗(yàn)小組需準(zhǔn)備試劑有:胰酶 50 mL;EDTA 50 mL;培養(yǎng)基90 mL(使用前加入10 mL血清)。 【實(shí)驗(yàn)步驟】 1PBS(1000mL)的配制分別稱取NaCl 8g;KCl 0.2g;Na2HPO4·12H2O 2.9g ;KH2PO4 0.2g于燒杯,加入800 mL三蒸水,玻棒攪動充分溶解后,倒入1000mL容量瓶中,用三蒸水定容至刻度。PBS用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制,余下高壓滅菌備用。2胰蛋白酶溶液(0.25%)的配制、除菌與分裝 稱取0.625g胰蛋白酶

5、于250 mL燒杯,加入1配制的PBS 200 mL,玻棒攪拌充分溶解后,倒入250 mL容量瓶中,用PBS定容至刻度。拿入超凈工作臺過濾除菌,并分裝至5個試劑瓶(100 mL),每瓶50 mL。試劑瓶均在酒精燈火焰上燒口加蓋,貼好標(biāo)簽,封口膜封口,放4 冰箱保存?zhèn)溆?。?biāo)簽上標(biāo)明:0.25%胰蛋白酶液、配制日期、以及組號與組長姓名。 3EDTA(0.2)的配制、除菌與分裝 稱取0.5 g EDTA 于250 mL燒杯,加入1配制的PBS 200 mL,溶解時加少量NaHCO3,調(diào)整pH為8.0,玻棒攪拌使EDTA充分溶解。再用 PBS定容到250 mL容量瓶里,終濃度為0.2%,用濃鹽酸,調(diào)p

6、H為7.2-7.4。裝于250 mL試劑瓶中,高壓滅菌備用。在超凈工作臺內(nèi),將已滅菌的EDTA溶液分裝至5個無菌試劑瓶(100 mL),每瓶50 mL。試劑瓶均在酒精燈火焰上燒口加蓋,貼好標(biāo)簽,封口膜封口,放4 冰箱保存?zhèn)溆?。?biāo)簽上標(biāo)明:0.2% EDTA、配制日期、以及組號與組長姓名。4培養(yǎng)基的配制、除菌與分裝 將培養(yǎng)基干粉(MEM或PRMI-1640)倒入1000 mL燒杯,加800mL三蒸水,玻棒攪拌充分溶解;再加入加1.8g HEPES和2.2g碳酸氫鈉,玻棒攪拌充分溶解,溶液呈橙色(弱酸性,pH在7.0左右);再倒入1000 mL容量瓶,用三蒸水定容至刻度。工作前打開超凈工作臺上的紫

7、外燈,滅菌30分鐘后,關(guān)閉紫外燈,打開吹風(fēng)和照明燈;帶橡膠手套,用酒精擦拭消毒雙手;超凈工作臺面用酒精噴灑,再用消毒紗布擦凈。在超凈工作臺中擺放好試劑瓶和濾器。將培養(yǎng)液拿入超凈工作臺過濾除菌,并分裝至5個無菌試劑瓶(100 mL),每瓶90 mL,余下裝入500 mL無菌試劑瓶,每瓶內(nèi)需加入無菌的GPS(谷氨酰胺-青霉素-鏈霉素),輕輕搖勻,使之終濃度為1%。試劑瓶均在酒精燈火焰上燒口加蓋,貼好標(biāo)簽,封口膜封口,放4 冰箱保存?zhèn)溆?。?biāo)簽上標(biāo)明:MEM或PRMI-1640、配制日期、以及組號與組長姓名。 用于細(xì)胞培養(yǎng)時,培養(yǎng)基內(nèi)需要加入血清,生長培養(yǎng)基內(nèi)血清濃度為10%。 【注意事項】1. 濾過

8、除菌時,將容量瓶內(nèi)的液體倒入燒杯內(nèi),再拿到超凈臺里,采用一次性濾器或是抽濾法除菌。 2. 培養(yǎng)基中的抗生素可在配置時加入青霉素和鏈霉素的粉末,也可在過濾除菌后加入無菌的液體,終濃度為100 U/mL 青霉素和100 g/mL鏈霉素。 【思考題】1. 配制細(xì)胞生長培養(yǎng)液時,需要添加哪些物質(zhì),為什么?如何調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH?2. 生長培養(yǎng)基中的血清一般在什么時候添加,為什么? 3. 細(xì)胞培養(yǎng)中的各種試劑的滅菌和除菌方法有哪些,如何使用? 實(shí)驗(yàn)二 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1. 掌握貼壁細(xì)胞換液和細(xì)胞傳代的方法。2. 了解細(xì)胞傳代培養(yǎng)的意義。【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞在培養(yǎng)瓶里的生長,分為貼壁生長和懸浮生長。

9、貼壁生長細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長數(shù)天后,就會在培養(yǎng)瓶底部長滿,如果不進(jìn)行處理,就會繼續(xù)生長而產(chǎn)生堆積,最后因缺乏營養(yǎng)供給而死亡。因此當(dāng)細(xì)胞生長貼滿瓶底時,就需要將細(xì)胞消化下來,并接種成多瓶細(xì)胞,使細(xì)胞繼續(xù)生長。這一處理接種的過程就叫傳代,每接種一次就叫做傳一代。細(xì)胞傳代培養(yǎng)使得細(xì)胞增殖,可獲得大量細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)所需。傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一,是幾乎所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。接種后的細(xì)胞放在培養(yǎng)箱里靜置培養(yǎng),培養(yǎng)的溫度視動物種類而定。一般,溫水性魚類細(xì)胞的最適培養(yǎng)溫度為25-28,冷水魚類細(xì)胞為15-20,水生哺乳動物細(xì)胞為37。細(xì)胞培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)培養(yǎng)基營養(yǎng)缺乏、代謝產(chǎn)物增多、變酸等不適宜細(xì)胞

10、生長因素,而此時細(xì)胞還未生長達(dá)到飽和密度(沒有貼滿底部),仍需繼續(xù)培養(yǎng),因而需要更新營養(yǎng)液來更新營養(yǎng)成分,以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖的需要,這一過程叫換液。單純換液不需要接種細(xì)胞。 【試劑、材料與儀器】試劑:生長培養(yǎng)基(PRMI-1640或 MEM,添加10% 小牛血清或胎牛血清),0.25% 胰蛋白酶,0.2% EDTA材料:細(xì)胞培養(yǎng)瓶,移液管(5 mL、10 mL),無菌離心管,廢液缸,普鑷,酒精燈,打火機(jī),醫(yī)用酒精,酒精噴壺,消毒紗布,記號筆,橡膠手套,封口膜儀器:生化培養(yǎng)箱或CO2培養(yǎng)箱,倒置生物顯微鏡,超凈工作臺,加液槍,低速離心機(jī),4冰箱【實(shí)驗(yàn)分組】 實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行,每組4人,每班20人

11、,共分5組?!緦?shí)驗(yàn)步驟】工作前打開超凈工作臺上的紫外燈,滅菌30分鐘后,關(guān)閉紫外燈,打開吹風(fēng)和照明燈;帶橡膠手套,用酒精擦拭消毒雙手;超凈工作臺面用酒精噴灑,再用消毒紗布擦凈。在超凈工作臺中擺放好移液管、離心管和培養(yǎng)瓶等。1 觀察細(xì)胞:倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),確定細(xì)胞是否需要傳代,當(dāng)細(xì)胞長滿瓶底時可以傳代;2 超凈工作臺準(zhǔn)備:將試劑瓶、培養(yǎng)瓶等培養(yǎng)用具用酒精噴灑,用消毒紗布擦凈,置于超凈工作臺酒精燈左側(cè);3 開蓋:旋開細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶蓋,將瓶蓋側(cè)立于(嚴(yán)禁倒扣放置)酒精燈旁,將培養(yǎng)瓶內(nèi)液體(舊培養(yǎng)基)倒入15 mL離心管,3000 rpm/min 離心5 min 備用。培養(yǎng)瓶瓶口、瓶蓋以及離心管

12、管口、管蓋均需過酒精燈火焰后再蓋好;4 清洗細(xì)胞表面:打開移液管盒,用普鑷捏住移液管(5mL)后部從盒子中拖出(注意移液管的管壁和管口不能碰到其他物品),安裝好加液槍,移液管管口和管壁均過酒精燈火焰。酌情吸取 2-4 mL EDTA溶液,清洗細(xì)胞表面,去掉殘留的舊培養(yǎng)基以及漂浮的死細(xì)胞,再倒棄EDTA溶液;5 胰酶消化:用移液管吸取2 mL 胰蛋白酶,從培養(yǎng)瓶側(cè)面加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi),蓋好瓶蓋后,在倒置顯微鏡下觀察,當(dāng)80%的細(xì)胞收回突起變圓時,立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞脫離胰酶;6 中和消化:用移液管吸取舊培養(yǎng)基上清液3 mL(也可用新鮮生長培養(yǎng)基),加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,終止胰酶消化,并反復(fù)輕輕吹打消

13、化好的細(xì)胞使其脫離瓶壁并分散;7 沉淀細(xì)胞:將細(xì)胞懸液吸入15 mL的離心管中,1000 rpm/min離心8分鐘,獲得細(xì)胞沉淀;8 加入新鮮培養(yǎng)基:倒棄上清液,保留細(xì)胞沉淀(注意只能倒一次,不能反復(fù)倒),然后用另一新移液管吸取10 mL的新鮮培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶中5mL,余下5mL加入離心管內(nèi)懸浮細(xì)胞沉淀,吸取離心管中的細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,與另外5mL培養(yǎng)基混勻;9 接種細(xì)胞:吸取5 mL上述的細(xì)胞懸液,加入另一個新細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,接種后2個培養(yǎng)瓶中的懸液各5 mL;10. 靜置培養(yǎng):蓋上瓶蓋,擰緊,標(biāo)記(包括細(xì)胞名稱、代數(shù)、傳代日期),放入常規(guī)的生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)(如果放入CO2培養(yǎng)箱,瓶

14、蓋擰緊后再稍回轉(zhuǎn));11. 觀察細(xì)胞:每天觀察細(xì)胞生長狀況,并確定是否進(jìn)行第2代的傳代?!咀⒁馐马棥?. 傳代培養(yǎng)時要注意無菌操作,所有操作要盡量靠近酒精燈火焰,手不能在瓶口上方操作,以免污染氣體進(jìn)入瓶內(nèi)。要防止細(xì)胞之間的交叉污染,每次最好只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作,每一種細(xì)胞使用一套器材。每種試劑使用一個移液管,培養(yǎng)用液要嚴(yán)格分開。2. 堅持每天觀察細(xì)胞,生長致密時即可傳代。如發(fā)現(xiàn)有污染跡象,應(yīng)丟棄污染的細(xì)胞。3. 細(xì)胞消化時要注意觀察,不要消化過度,否則細(xì)胞不宜存活。吹打細(xì)胞時,確保瓶壁所有地方均吹打到,吹打時動作要輕柔,不要用力過大,以防細(xì)胞破碎。4. 培養(yǎng)箱不要反復(fù)多次開關(guān),以免影響溫度的穩(wěn)

15、定和增加污染的機(jī)率。 【思考題】1. 貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法及注意事項。2. 常用的細(xì)胞消化液有哪些? 各種消化液的作用原理分別是什么?3. 懸浮生長的細(xì)胞如何傳代培養(yǎng)?實(shí)驗(yàn)三 魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)(組織塊法)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)的組織塊法。2. 了解細(xì)胞原代培養(yǎng)的酶消化法和機(jī)械分離法?!緦?shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)常用方法有組織塊法、酶消化法和機(jī)械分離法等。組織塊法是直接從生物體獲取組織,切割成微小的組織塊,然后貼附于培養(yǎng)瓶底部,通過培養(yǎng)液供給營養(yǎng),在合適的溫度中孵育,讓組織塊周邊慢慢地長出細(xì)胞來,經(jīng)消化傳代,獲得大量均一的細(xì)胞,用于傳代培養(yǎng)和相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

16、。 【試劑、材料與儀器】試劑:MEM培養(yǎng)基,GPS,兩性霉素B,硫酸慶大霉素,表皮生長因子(EGF),成纖維生長因子(FGF)材料:試驗(yàn)幼魚,原代培養(yǎng)瓶,無菌培養(yǎng)皿,移液管(5 mL),無菌離心管(15 ml),解剖探針,手術(shù)剪,眼科剪,眼科鑷,手術(shù)刀,醫(yī)用酒精,燒杯(250 mL),廢液缸,普鑷,酒精燈,打火機(jī),消毒紗布,酒精噴壺,記號筆,橡膠手套,封口膜儀器:生化培養(yǎng)箱或CO2培養(yǎng)箱,倒置生物顯微鏡,超凈工作臺,加液槍,4冰箱【實(shí)驗(yàn)分組】實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行,每組4人,每班20人,共分5組,每組中分別取肌肉、鰭條、肝和鰾4種組織。 【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 試劑配制抗生素培養(yǎng)基(AIM): 90 mL培養(yǎng)

17、液(2×MEM)+ 5 mL GPS(10×)+5 mL兩性霉素B(250 g/mL)+1 mL硫酸慶大霉素(50 mg/mL)混合,4保存?zhèn)溆?。原代培養(yǎng)基:80 mL培養(yǎng)液 + 2 mL GPS (10×) + 20 mL FBS + EGF(2 g/mL)+ FGF(25 ng/mL)混合,4保存?zhèn)溆?。傳代培養(yǎng)基:90 mL培養(yǎng)液 + 1 mL GPS (10×) + 10 mL FBS混合,4保存?zhèn)溆谩?. 組織分離和細(xì)胞培養(yǎng)工作前打開超凈工作臺上的紫外燈,滅菌30分鐘后,關(guān)閉紫外燈,打開吹風(fēng)和照明燈;帶橡膠手套,用酒精擦拭消毒雙手;超凈工作臺面用

18、酒精噴灑,再用消毒紗布擦凈。在超凈工作臺中擺放好培養(yǎng)皿、移液管和培養(yǎng)瓶。將滅過菌的手術(shù)器械(解剖刀2把,眼科鑷2把,眼科剪1把)插入盛有醫(yī)用酒精的玻璃燒杯中浸泡備用。以下操作均在超凈臺里進(jìn)行: 1) 殺幼魚與消毒體表:用解剖探針破壞幼魚腦后,將幼魚置于酒精中,浸泡30秒。 2) 取肌肉與鰭條:用消毒紗布托住魚體,用手術(shù)剪取下鰭條或背部肌肉,并置于盛有AIM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(1)內(nèi)浸泡消毒,培養(yǎng)皿上寫上組織名稱。3) 用紗布擦去手術(shù)器械上的殘余組織,將手術(shù)器械放入盛有醫(yī)用酒精的燒杯中涮洗浸泡。用眼科剪打開體腔,用眼科鑷取出肝或鰾,并置于盛有AIM的培養(yǎng)皿(2)內(nèi)浸泡消毒,培養(yǎng)皿上寫上組織名稱。注意

19、:取體表和體內(nèi)不同的組織時,手術(shù)器械應(yīng)分開并浸泡消毒,防止組織細(xì)胞交叉污染。4) 組織塊在AIM內(nèi)浸泡2小時,每半小時換1次AIM培養(yǎng)基。換液方法:涮洗AIM中的組織塊,倒去舊液,用移液管吸取新鮮AIM加入培養(yǎng)皿內(nèi)。5) 用眼科鑷夾取組織塊,移入無菌培養(yǎng)皿(3)內(nèi),用手術(shù)刀切除和刮去多余的組織,如脂肪和壞死組織,血液、筋膜等,再用新移液管吸AIM清洗組織塊1-2次。6) 將組織塊移入無菌培養(yǎng)皿(4)內(nèi),用手術(shù)刀將組織塊切成約1mm2的小塊,用新移液管吸取AIM少量,將組織碎塊浸潤。7) 打開培養(yǎng)瓶蓋,用新移液管吸取濕潤的微小組織塊(約20-30個),接種于25 cm2培養(yǎng)瓶底部,用移液管將組織

20、塊涂抹均勻,培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋過酒精燈火焰后再蓋好擰緊,培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記(包括組織名稱和原代培養(yǎng)日期)。8) 將培養(yǎng)瓶拿到培養(yǎng)箱內(nèi),靜置貼壁2小時,再將培養(yǎng)瓶側(cè)放半小時,用移液管將殘余液體吸出。9) 用新移液管從細(xì)胞培養(yǎng)瓶側(cè)面緩慢加入 4-5 mL原代培養(yǎng)基,培養(yǎng)瓶保持豎立,培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋過酒精燈火焰后再蓋好擰緊。小心將細(xì)胞培養(yǎng)瓶拿入培養(yǎng)箱內(nèi),緩慢輕柔地將培養(yǎng)瓶平放(讓培養(yǎng)基慢慢浸潤組織塊,避免組織塊脫離瓶壁漂浮),靜置培養(yǎng)。10) 注意觀察細(xì)胞生長情況,大約1-2周后,細(xì)胞開始從組織塊底部延伸出來。當(dāng)細(xì)胞長滿時,可消化傳代,原瓶可保留繼續(xù)生長細(xì)胞?!咀⒁馐马棥? 盡量選取幼年的生物體組織或者

21、繁殖能力較強(qiáng)的組織,如幼魚、胚胎、腫瘤組織等,作為實(shí)驗(yàn)材料。2 原代培養(yǎng)時要注意無菌操作,所有操作要盡量靠近酒精燈火焰,手不能在瓶口上方操作,以免污染氣體進(jìn)入瓶內(nèi)。要防止組織之間的交叉污染,注意更換移液管。3 組織塊要靜置貼壁2小時,能黏附于瓶壁時,再與加入培養(yǎng)液,操作要輕且緩慢,勿使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有貼壁,細(xì)胞則不易生長。如組織塊漂浮,需重新貼壁!【思考題】1. 細(xì)胞原代培養(yǎng)(組織塊法)的方法及注意事項。2. 常用的細(xì)胞原代培養(yǎng)方法有哪些?分別適用于哪些組織?實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞的凍存【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握細(xì)胞保存的方法2. 熟悉細(xì)胞凍存的原理【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一

22、。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196液氮中低溫保存,可以使細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài)而保持細(xì)胞特性,在需要的時候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。凍存細(xì)胞還起到了細(xì)胞保種的作用,可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種。細(xì)胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO,終濃度5 - 15%),可使溶液冰點(diǎn)降低,在緩慢凍結(jié)條件下,細(xì)胞內(nèi)水分透出,減少了冰晶形成,從而避免細(xì)胞損傷。采用“慢凍快融”的方法能較好地保證細(xì)胞的存活。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為 -1- -2/min,當(dāng)溫度低于- 25時可加速,到- 80之后可直接投入液氮內(nèi)(-196)。【試劑、材料與儀器】試劑:生長培養(yǎng)基(PRMI-1640或 MEM

23、,添加10% 小牛血清或胎牛血清),0.25% 胰蛋白酶,0.2% EDTA,二甲基亞砜(DMSO),液氮,異丙醇材料:凍存管,移液管(2 mL、5 mL),無菌離心管,廢液缸,普鑷,酒精燈,打火機(jī),消毒紗布,醫(yī)用酒精,酒精噴壺,記號筆,橡膠手套,封口膜儀器:倒置生物顯微鏡,超凈工作臺,加液槍,低速離心機(jī),4冰箱,-80冰箱,程序降溫盒,液氮罐,制冰機(jī)【實(shí)驗(yàn)分組】實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行,每組4人,每班20人,共分5組。 【實(shí)驗(yàn)步驟】工作前打開超凈工作臺上的紫外燈,滅菌30分鐘后,關(guān)閉紫外燈,打開吹風(fēng)和照明燈;帶橡膠手套,用酒精擦拭消毒雙手;超凈工作臺面用酒精噴灑,再用消毒紗布擦凈。程序降溫盒盛裝異丙醇,

24、使用前4預(yù)冷。在超凈工作臺中擺放好凍存管、移液管、離心管和試劑瓶。凍存管上作好標(biāo)記,包括細(xì)胞名稱,代數(shù)和凍存日期。1. 收集細(xì)胞:取待凍存的細(xì)胞,倒棄舊液,用移液管吸取2-4 mL EDTA清洗細(xì)胞表面, 棄去,再吸取2 mL胰蛋白酶加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶,消化1-2分鐘,輕輕拍打瓶側(cè),使細(xì)胞脫離瓶底。加入2 mL培養(yǎng)基將細(xì)胞輕輕吹打沖洗下來,移入15 mL離心管,1000 rpm/min離心7 min,棄上清,保留離心管底部細(xì)胞沉淀。2. 細(xì)胞凍存液的配制:在15 mL離心管中依次加入:DMSO 0.6 mL、新鮮培養(yǎng)液 1.8 mL和血清0.6 mL,作為A液(3 mL)。輕輕吹打混勻,離心管加蓋

25、后立即插入冰里。注意吸取試劑時,移液管均需更換,不能混用。3. 凍存細(xì)胞:在1步獲得的細(xì)胞沉淀中,加入3 mL培養(yǎng)液,輕輕吹打混勻,制成細(xì)胞懸?。˙液)。吸取細(xì)胞懸液(B液)與A液均勻混合。混合時,從離心管底部向上緩慢拖著滴加,邊加邊轉(zhuǎn)動移液管,使細(xì)胞與凍存液充分混勻?;旌虾蠹?xì)胞懸液為6 mL,分裝于凍存管中,每管1-1.5 mL,蓋好凍存管蓋,放入盛有異丙醇的程序降溫盒中,立即放入-80,24小時后,將裝有細(xì)胞的凍存管轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi),并做好記錄。 【注意事項】1 凍存液需現(xiàn)配現(xiàn)用,配制好后放置在冰中,保持低溫。凍存液中含20%血清和10% DMSO,配制時添加血清和DMSO要錯開,即血清和DM

26、SO二者不能直接混合。2 程序降溫盒要提前裝好異丙醇,且4預(yù)冷。3 凍存管內(nèi)細(xì)胞的密度通常為105-106個/ mL,一般鋪滿一個25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞量可以凍存1-2mL。4 準(zhǔn)備進(jìn)行凍存的細(xì)胞,要處于對數(shù)生長期,即細(xì)胞傳代后24h 左右,且細(xì)胞生長狀態(tài)良好,這樣才能保證凍存細(xì)胞復(fù)蘇時,有較高的存活率。5 要準(zhǔn)確記錄凍存細(xì)胞的種類,代數(shù),凍存時間和凍存者的姓名。【思考題】1 為什么要配制細(xì)胞凍存(A液),并將細(xì)胞懸液(B液)與之混合? 2 凍存細(xì)胞時,為什么要加入二甲基亞砜?為什么要緩慢降溫?實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞的復(fù)蘇【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握細(xì)胞復(fù)蘇的方法2. 熟悉細(xì)胞復(fù)蘇的原理【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)

27、胞復(fù)蘇時要快速融化,必須將凍存在-196液氮中的細(xì)胞快速融化,使細(xì)胞凍存時產(chǎn)生的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶,對細(xì)胞造成損害。復(fù)蘇后的細(xì)胞可繼續(xù)進(jìn)行傳代增殖,做實(shí)驗(yàn)材料和再次凍存?!驹噭?、材料與儀器】試劑:生長培養(yǎng)基(PRMI-1640或 MEM,添加10% 小牛血清或胎牛血清)材料:細(xì)胞培養(yǎng)瓶,移液管(5 mL、10 mL),無菌離心管,廢液缸,普鑷,酒精燈,打火機(jī),消毒紗布,醫(yī)用酒精,酒精噴壺,記號筆,橡膠手套,封口膜儀器:生化培養(yǎng)箱或CO2培養(yǎng)箱,倒置生物顯微鏡,超凈工作臺,加液槍,低速離心機(jī),水浴鍋,液氮罐【實(shí)驗(yàn)分組】 實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行,每組4人,每班20人,共分5組

28、。 【實(shí)驗(yàn)步驟】 工作前打開超凈工作臺上的紫外燈,滅菌30分鐘后,關(guān)閉紫外燈,打開吹風(fēng)和照明燈;帶橡膠手套,用酒精擦拭消毒雙手;超凈工作臺面用酒精噴灑,再用消毒紗布擦凈。將水浴鍋預(yù)熱至37,在超凈工作臺中擺放好移液管、離心管和培養(yǎng)瓶。1. 取出凍存管:根據(jù)細(xì)胞凍存記錄找到所需細(xì)胞存放之處,從液氮罐中取出待復(fù)蘇細(xì)胞。 2. 迅速解凍:立即將凍存管放入37溫水中迅速解凍,要不斷晃動凍存管,大約在1min內(nèi)使凍存管內(nèi)液體完全溶解。取出凍存管,酒精噴灑擦拭凍存管蓋周邊,拿入超凈工作臺。3. 加培養(yǎng)液:吸取凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液,加入離心管,再向離心管內(nèi)加入5-8 mL生長培養(yǎng)液,1000 rpm

29、/min 離心8 min,獲得細(xì)胞沉淀。倒棄上清,加入4-5 mL 生長培養(yǎng)基,輕輕吹打混勻細(xì)胞,將細(xì)胞移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶。4. 貼壁與換液:將細(xì)胞于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24小時,觀察細(xì)胞貼壁情況。吸去舊液, 加入新鮮生長培養(yǎng)基。【注意事項】1. 細(xì)胞復(fù)蘇時,注意融化凍存細(xì)胞速度要快,可不時搖動冷凍管,使之盡快通過最易受損的溫度段(-50)。這樣復(fù)蘇的凍存細(xì)胞存活率高,細(xì)胞生長及形態(tài)良好。2. 由于凍存的細(xì)胞中會有部分細(xì)胞死亡,靜置培養(yǎng)24小時后,可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上的死細(xì)胞棄去,更換新鮮培養(yǎng)液。3. 如果凍存的細(xì)胞保存時間較長或之前細(xì)胞復(fù)蘇時,細(xì)胞存活率不高,可以直接在培養(yǎng)瓶內(nèi)加入凍存管內(nèi)的細(xì)

30、胞懸液和5 mL的新鮮培養(yǎng)基,靜置培養(yǎng)10-12h后,更換新鮮培養(yǎng)基?!舅伎碱}】1 復(fù)蘇細(xì)胞時,為什么要快速融化? 2 如果凍存管內(nèi)的細(xì)胞密度偏低,復(fù)蘇時如何處理? 實(shí)驗(yàn)六 染色體制備【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握培養(yǎng)細(xì)胞的染色體的制備方法2. 熟悉細(xì)胞染色體制備的原理【實(shí)驗(yàn)原理】每一物種的細(xì)胞一般都具有一定數(shù)目、形狀和大小的染色體。在秋水仙素的作用下可使分裂細(xì)胞阻斷在中期,此時染色體形態(tài)最典型,然后通過低滲、固定、染色等步驟,便可在顯微鏡下呈現(xiàn)出其形態(tài)。 【試劑、材料與儀器】試劑:生長培養(yǎng)基(PRMI-1640或 MEM,添加10% 小牛血清或胎牛血清),0.25% 胰蛋白酶,0.2% EDTA,PBS,冰醋酸,甲醇,秋水仙堿,95%乙醇,HCl ,Giemsa染液,雙蒸水材料:細(xì)胞培養(yǎng)瓶,移液管(5 mL、10 mL),無菌離心管,載玻片,膠頭滴管,染色缸,廢液缸,普鑷,酒精燈,打火機(jī),消毒紗布,醫(yī)用酒精,酒精噴壺,記號筆,橡膠手套,封口膜儀器:生化培養(yǎng)箱或CO2培養(yǎng)箱,倒置生物顯微鏡,超凈工作臺,加液槍,低速離心機(jī),切片烘干機(jī),制冰機(jī),水浴

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