病毒的分離鑒定

1、病毒的分離與鑒定要證明某種疾病是由某一感染性病毒所引起，則必須滿足以下原則：從患病者體內(nèi)分離出病毒；在實(shí)驗(yàn)動物或寄主細(xì)胞中可以培養(yǎng)；證明這種培養(yǎng)物具有濾過性；在原始宿主或相關(guān)種屬內(nèi)能產(chǎn)生同樣的病癥；能重新分離出病毒。1. 病毒的分離1.1 標(biāo)本的處理1.1.1 標(biāo)本的收集a) 糞便標(biāo)本：將 5g 糞便標(biāo)本和 50ml PBS 放入盛有 20-25 顆玻璃小珠的 100ml 無菌瓶中，攪拌成懸液，倒出上清， 3000×g，4離心 6min 。b) 拭子和生物體液：拭子浸在 2-3ml 運(yùn)載培養(yǎng)基中，將棉拭子中的液體盡量擠出以獲得標(biāo)本， 如果液體被污染， 應(yīng) 3000×g 4離

2、心30min。c) 組織標(biāo)本：用無菌乳缽或勻漿器研磨組織標(biāo)本，同時(shí)加入足量的PBS 制備成 20%的懸液， 3000×g 4離心 30min。1.1.2 除菌處理a) 糞便可加青鏈霉素使最終濃度為 10000 單位 /毫升，置 4過夜。b) 鼻咽拭子一般加抗生素最終濃度為 2000 單位 /毫升，置 4作用 4 小時(shí)。c) 對乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、 腸道病毒、呼腸孤病毒、腺病毒、痘病毒等，則可加入等量的乙醚 4過夜除菌。1.2 病毒的分離培養(yǎng)病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物， 培養(yǎng)病毒必須使用細(xì)胞。 根據(jù)病毒的不同選用敏感動物（動物接種） 、雞胚（雞胚接種）或離體細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)（細(xì)

3、胞培養(yǎng)） 。1.2.1 雞胚接種a) 雞卵的選擇：一般都選新鮮、 10 天以內(nèi)的受精卵以保證規(guī)格質(zhì)量上的一致 。b) 孵育：孵育時(shí)可將雞卵放入卵箱內(nèi)進(jìn)行 ,氣室向上，孵育的最適溫度為 38-39 ，相對濕度為 4070，孵育 8 日后，雞卵應(yīng)每天翻動 12次，以幫助雞胚發(fā)育勻稱和防止雞胚膜粘連。c) 檢卵：雞卵孵育 45 天后，即可用檢卵器檢查雞胚發(fā)育情況（二天一次）。未受精雞卵：在檢卵器上僅見到模糊的陰影。活雞卵：雞胚發(fā)育 4 天后，在檢卵器上就可見到清晰的血管，雞卵內(nèi)有一小黑點(diǎn)（雞胚），有明顯的自然轉(zhuǎn)動。死胎：如果發(fā)現(xiàn)雞卵血管模糊、擴(kuò)張、胚胎活動呆滯或不能自主地轉(zhuǎn)動，則可判斷胚胎頻死或已經(jīng)

4、死亡，應(yīng)將其挑撿出來。雞胚孵育完畢后，用鉛筆劃出氣室邊緣和胚胎的位置待用。d) 接種：圖 1. 雞胚卵黃囊接種：用5 8天雞胚，以細(xì)長針頭由雞卵氣室端刺入卵黃囊。孵育后取獲卵黃囊膜檢查。常用于某些嗜神經(jīng)病毒的分離。圖 2. 雞胚羊膜腔接種：用1214 天雞胚，將檢材注入羊膜腔，孵育后取羊水檢查。常用于流感病毒的初次分離。圖 3. 尿囊腔接種用 9 12 天雞胚，將標(biāo)本接種于尿囊腔, 孵育后取尿囊液檢查, 常用于培養(yǎng)流感病毒和腮腺炎病毒等。圖 4. 絨毛尿囊膜接種：用 10 l 2 天雞胚，以無菌手續(xù)在蛋殼上開小窗，然后將材料滴在絨毛尿囊膜上孵育后。觀察膜上有無斑點(diǎn)病變。常用于培養(yǎng)單純皰疹病毒、

5、天花病毒和痘病毒。e) 剖檢及收獲收獲前雞胚應(yīng)置4冰箱過夜，使雞胚內(nèi)血液凝固。收獲時(shí)，用碘酒將氣室部卵殼消毒，將氣室處卵殼剝?nèi)ィú灰獙⑺槠淙霘つぃ?。然后用無菌手術(shù)刀柄從胚胎背部輕輕下壓，（切勿壓破卵黃囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶內(nèi)，于低溫保存。f) 優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)簡單、來源充沛、價(jià)格低廉、數(shù)量可大、不需特殊設(shè)備。缺點(diǎn)：很多病毒不能適應(yīng)，主要是哺乳動物的病毒。1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) (cell culture)是指利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使動物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至 24 個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的類型和培養(yǎng)細(xì)胞代數(shù)的不同，可將其分為兩種：原代細(xì)胞培養(yǎng)；傳代細(xì)胞培養(yǎng)。

6、組織細(xì)胞培養(yǎng)的病毒，當(dāng)出現(xiàn)穩(wěn)定的細(xì)胞病變后，就可取培養(yǎng)液或培養(yǎng)液與細(xì)胞培養(yǎng)物混和物，細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒可采用凍融、超聲波等方法使其釋放出來。 優(yōu)點(diǎn)：a) 每個(gè)細(xì)胞生理特性基本一致，對病毒易感性相等；b) 無個(gè)體差異，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好；c) 可嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作；d) 細(xì)胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長特征；e) 應(yīng)用空斑技術(shù)可進(jìn)行病毒的克隆化。2. 病毒的鑒定2.1形態(tài)學(xué)鑒定細(xì)胞病變效應(yīng)（ cytopathic effect，CPE）：病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖后，可引起細(xì)胞的不同變化。常見的形態(tài)學(xué)改變?nèi)缂?xì)胞圓縮、聚合、溶解或脫落。 CPE 出現(xiàn)的時(shí)間是鑒定病毒的標(biāo)志之一。某些病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變

7、化，在普通光學(xué)顯微鏡下可見胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小數(shù)量不等的圓形或不規(guī)則形的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，病毒學(xué)上稱為包涵體。2.2血吸附和血凝作用多見于以出芽方式釋放的病毒。血吸附指感染細(xì)胞具有吸附紅細(xì)胞的能力；血凝作用指感染細(xì)胞的培養(yǎng)液中有許多游離病毒存在，具有凝集紅細(xì)胞的作用。2.2.1 血吸附實(shí)驗(yàn)具有血凝能力的病毒能使感染的細(xì)胞吸附紅細(xì)胞，這種現(xiàn)象被稱作吸附作用。大多數(shù)粘液病毒能引起吸附。具體檢驗(yàn)步驟如下：a) 用 PBS 配制 10%的豚鼠紅細(xì)胞懸液， 4保存，用前按需要量稀釋成 0.5%的濃度（ 10%懸液 1ml 加 19ml PBS 混勻）。b) 吸去對照和試驗(yàn)管培養(yǎng)細(xì)胞的上

8、清液，試驗(yàn)管的上清液留待電鏡觀察。c) 每管加入 0.2ml 紅細(xì)胞懸液， 4孵育 30min。用 4的 PBS 清洗培養(yǎng)細(xì)胞 3 次。d) 顯微鏡下讀取結(jié)果并記錄，根據(jù)吸附紅細(xì)胞的量可分為0（陰性） 4（完全吸附）級。e) 37孵育 60min，有神經(jīng)氨酸酶的病毒將會從紅細(xì)胞上游離下來。2.2.2 血凝實(shí)驗(yàn)a) 在血凝板第一排的 112 孔加入 50l 生理鹽水。b) 在第 1 孔中加入 50l 病毒，混勻后吸 50l 到第 2 孔，如此倍比稀釋直到第 10 孔，混勻后棄 50l；最后兩孔（ 11、12）為紅細(xì)胞對照。c)將 1%的紅細(xì)胞輕輕搖動混勻，在112 孔中每孔加入 50l 。d)

9、手工震蕩， 37靜置 30min（室溫 40min）后觀察結(jié)果。2.3電子顯微鏡檢查病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等必須借助電子顯微鏡進(jìn)行檢查。對于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒，可直接從感染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)收獲的材料作電子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子。2.3.1 正染法：超薄切片法取材固定（戊二醛 /四氧化鋨）清洗與脫水浸透、包埋與聚合切片染色（鈾染 /鉛染）a) 優(yōu)點(diǎn)：可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過程。b) 缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，但標(biāo)本可長時(shí)間保存。2.3.2 負(fù)染技術(shù)負(fù)染是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強(qiáng)樣品外周的電子密度，使樣品顯示負(fù)的反差，襯托出樣品的

10、形態(tài)和大小。具體步驟（漂浮法）為：現(xiàn)將需負(fù)染的樣品滴幾滴在干凈的載玻片上，再將有支持膜的載網(wǎng)漂浮在樣品液滴上以沾取樣品，用濾紙吸干樣品余液使樣品在載網(wǎng)上僅有一薄層液膜，在樣品未干時(shí)即加一滴復(fù)染液的銅網(wǎng)上，用濾紙吸干多余的染液即可。a) 優(yōu)點(diǎn)：快速簡易（ 10-20min）；分辨率高；圖象清晰地病毒結(jié)構(gòu)。b) 缺點(diǎn)：敏感性低，要求病毒量在 107 以上；所有樣品應(yīng)處于懸浮狀態(tài)。2.4血清學(xué)試驗(yàn)可采用 ELISA 、瓊脂擴(kuò)散、中和試驗(yàn)、標(biāo)記抗體技術(shù)等免疫血清學(xué)方法檢查病畜的抗體消長情況和發(fā)病組織中的病毒抗原。2.4.1 中和反應(yīng)利用病毒與特異性中和抗體結(jié)合的特性鑒定病毒的種類，觀察特異性抗體能否保護(hù)易感的試驗(yàn)動物死亡，能否抑制病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)