蛋白質(zhì)等電點測定

1、蛋白質(zhì)等電點測定 及性質(zhì)實驗一、目得：了解等電點得意義及其與蛋白質(zhì)分子聚沉能力得關(guān)系。初步學(xué)會測定蛋白質(zhì)等電點得基本方法，了解蛋白質(zhì)得性質(zhì)。二、原理:固體顆粒在液體中為什么能夠帶電當(dāng)固體與液體接觸時，固體可以從溶液中選擇性吸附某種離子，也可以就是固體分子本身發(fā)生電離作用而使離子進入溶液，以致使固液兩相分別帶有不同符號得電荷，由于電中性得要求，帶電表面附近得液體中必有與固體表面電荷 數(shù)量相等但符號相反得多余得反離子。在界面上 帶電表面與反離子 形成了雙電層得結(jié)構(gòu)。在兩種不同物質(zhì)得 界面上，正負(fù)電荷分別排列成得面層。對于雙電層得具體結(jié)構(gòu)，一百多年來不同學(xué)者提出了不同得瞧法。最早于1879 年H e

2、1 mhol Z提出平板型模型；1 9 1 0年Gouy與1 913年Ch ap ma n修正了平板型模型，提出了擴散雙電層模型；后來 Stern又提出了 Ster n模型.根據(jù)0、斯特恩得觀點，一部分反離子由于電性吸引或非電性得特性吸引作用（例如范德華力）而與表面緊密結(jié)合，構(gòu)成吸附層（或稱緊密層、斯特恩層）.其余得離子則擴散地分布在溶液中，構(gòu)成雙電層得 擴散層（或稱滑移面）.由于帶電表面得吸引作用，在擴散層中反離子得濃，過剩得反離子越少，直至在溶液內(nèi)部反離子得濃度與同號離度遠(yuǎn)大于同號離子。離表面越遠(yuǎn)緊密層：溶液中反離子及溶劑分子受到足夠大得靜電力，范德華力或特性吸附力，而緊密吸附在固體表面上

3、 .其余反離子則構(gòu)成擴散層?；瑒用?:指固液兩相發(fā)生相對移動得界面 ,就是凹凸不平得曲面。滑動面至溶液本體間得電勢差稱為Z電勢。固體顆粒帶電量得大小及測量方式？Z電勢只有在固液兩相發(fā)生相對移動時才能呈現(xiàn)出來。Z電勢得大小由Zeta電位表示,擴散層越厚。一般來其數(shù)值得大小反映了膠粒帶電得程度，其數(shù)值越高表明膠粒帶電越多 說,以p H值為橫坐標(biāo)，Zeta電位為縱坐標(biāo)作圖，Z eta電位為零對應(yīng)得 pH值即為等電點。對于蛋白質(zhì)分子來說 :蛋白質(zhì)分子得大小在膠粒范圍內(nèi)，約11 00微米。大部分蛋白質(zhì)分子得表面都有很多親水集團，這些集團以氫鍵形式與水分子進行水合作用,使水分子吸附在蛋白質(zhì)分子表面而形成一

4、層水合膜 ,具有親水性 ;又由于蛋白質(zhì)分子表面得親水集團都帶有電荷，會與極性水分子中得異性電荷吸引形成雙電層.而水合膜與雙電層得存在 ,使蛋白質(zhì)得分子與分子之間不會相互凝聚 ,成為比較穩(wěn)定得膠體溶液。如果消除水合膜或雙電層其中一個因素,蛋白質(zhì)溶液就會變得不穩(wěn)定， 兩種因素都消除時， 蛋白質(zhì)分子就會互相凝聚成較大得分子而產(chǎn)生沉淀。生活實踐中 ，常利用蛋白質(zhì)得膠體性質(zhì)沉淀或分離蛋白質(zhì).如做豆腐、肉皮凍就就是利用蛋白質(zhì)得膠凝作用 .蛋白質(zhì)分子所帶得電荷與溶液得pH值有很大關(guān)系，蛋白質(zhì)就是兩性電解質(zhì),在酸性溶液中得氨基酸分子氨基形成 一N H 3+而帶正電，在堿性溶液中羧基形成 一COO-而帶負(fù)電：蛋

5、白質(zhì)分子所帶凈電荷為零時得pH值稱為蛋白質(zhì)得等電點（PI）。其定義為：在某一 PH得溶液中，蛋白質(zhì)解離成陽離子與陰離子得趨勢或程度相等時，呈電中性,此時溶液得pH稱為該蛋白質(zhì)得等電點。等電點得應(yīng)用 :主要用于蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)得分離、提純與電泳。蛋白質(zhì)等電點得測量方式：溶解度最低時得溶液pH。在等電點時 ,蛋白質(zhì)分子在電場中不向任何一極移動,而且分子與分子間因碰撞而引起,且溶液變混濁。蛋聚沉得傾向增加 ,所以這時可以使蛋白質(zhì)溶液得粘度、滲透壓均減到最低白質(zhì)在等電點時溶解度最小 ,最容易沉淀析出。蛋白質(zhì)等電點得測定 各種蛋白質(zhì)得等電點都不相同 ，但偏酸性得較多，如牛乳中得酪蛋白得等電點就是4、7

6、4、8,血紅蛋白等電點為6、76、8,胰島素就是5、35、4，魚精蛋白就是一個典型得堿性蛋白，其等電點在 pH 1 2、0 1 2、4。本實驗采用蛋白質(zhì)在不同pH溶液中形成得混濁度來確定，即混濁度最大時得pH值即為該種蛋白質(zhì)得等電點值，這個方法雖然不很準(zhǔn)確，但在一般實驗條件下都能進行，操作也簡便.蛋白質(zhì)得等電點比較準(zhǔn)確得方法就是采用等電聚焦技術(shù)加以準(zhǔn)確測定,但需一定得實驗條件。等電聚焦電泳（IEF,isoel ec trief ocu si ng ele ct ro p h o r es is )利用特殊得一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個pH梯度,電泳時每種蛋白質(zhì)

7、就將遷移到等于其等電點(pI）得pH處（此時此蛋白質(zhì)不再帶有凈得正或負(fù)電荷）,形成一個很窄得區(qū)帶.IEF得基本原理在IEF得電泳中，具有pH梯度得介質(zhì)其分布就是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點得特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷向陽極移動，直至某一 pH位點時失去電荷而停止移動， 此處介質(zhì)得pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子得等電點（p l）。同理，位于酸性區(qū)域得蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動,直到它們得等電點上聚焦為止?？梢娫谠摲椒ㄖ?，等電點就是蛋白質(zhì)組分得特性量度，將等電點不同得蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度得凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后， 各組分將分別聚

8、焦在各自等電點相應(yīng)得pH位置上，形成分離得蛋白質(zhì)區(qū)帶。沉淀反應(yīng)：蛋白質(zhì)在某種理化條件下，蛋白膠體溶液得水化層或者電荷層破壞，蛋白膠體相互聚集得現(xiàn)象。主要得沉淀現(xiàn)象有（1）鹽析:在蛋白質(zhì)水溶液中加入足量得鹽類（如硫酸銨），可析出沉淀，稀釋后能溶解并仍保持原來得性質(zhì)，不影響蛋白質(zhì)得活性.這就是一個可逆得過程,可用于蛋白質(zhì)得分離與初級提純。（2）變性：在重金屬鹽、強酸、強堿、加熱、紫外線等作用下，引起蛋白質(zhì)某些理性質(zhì)改變與生物學(xué)功能喪失。這就是一個不可逆過程。（3）加入一定量得溶劑如乙醇、丙酮，它們與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，破壞水化膜，短時間內(nèi)就是可逆反應(yīng)；（4 ）加入生物堿試劑（含氮得堿性物質(zhì)）:能

9、使生物堿沉淀或作用產(chǎn)生顏色反應(yīng)得物質(zhì)，稱為生物堿試劑.當(dāng)溶液得pH小于PI時,蛋白質(zhì)為陽離子，能與生物堿試劑得陰離子結(jié)合而生成沉淀.酪蛋白就是牛奶蛋白質(zhì)得主要成分，常溫下在水中可溶解 0、81、2%，微溶于25度水與有機溶劑，溶于稀堿與濃酸中，能吸收水分。當(dāng)浸入水中則迅速膨脹。在牛奶中以磷酸二鈣、三鈣或兩者得復(fù)合物形式存在。構(gòu)造極為復(fù)雜，沒有確定得分子式。分子量約為57000375000,在牛奶中約含3%,占牛奶蛋白質(zhì)得8 0 %。1三、器材及試劑:1。器材： 試管1、5 X厘米（X9 ）。 吸管1毫升（X 2）,2毫升（X 2）, 1 0毫升（X 2）. 容量瓶50毫升（X 2 ）,500毫

10、升（X1 ）. 試管架.2 .試劑:0、01mo ! L 1醋酸溶液.？?0、1 mol - L 1醋酸溶液。1 mol-L 一1醋酸溶液.1 m ol L-1氫氧化鈉溶液（氫氧化鈉與醋酸溶液得濃度要標(biāo)定 酪蛋白。四、操作步驟:1.制備蛋白質(zhì)膠液（1）稱取酪蛋白3克，放在燒杯中，加入40C得蒸餾水。（2）加入5 0毫升1 m 0 lL-1氫氧化鈉溶液，微熱攪拌直到蛋白質(zhì)完全溶解為止.將溶解好得蛋白溶液轉(zhuǎn)移到500毫升容量瓶中，并用少量蒸餾水洗凈燒杯，一并倒入容量瓶.（3）在容量瓶中再加入1 m 01 1醋酸溶液5 0毫升,搖勻。（4 ）加入蒸餾水定容至 50 0毫升，得到略現(xiàn)渾濁得，在0、1m

11、ol - L-1N aA C 溶液中得酪蛋白膠體。2. 等電點測定，加按下表順序在各管中加入蛋白質(zhì)膠液，并準(zhǔn)確地加入蒸餾水與各種濃度得醋酸溶液入后立即搖勻.管號蛋白質(zhì)膠液（毫升）H 2 0 （毫升）0、0 1mol L 1HAC（毫升）0、1 m ol L-1H AC（毫升）1 mol L1HA C（毫升）P H觀察0分鐘1 0分鐘20分鐘11& 380、625、9217、751、2 55、6318、750、255、3418、500、505、0518、0 0-1、004、77、002、00-4、45、004、00-4、11、008、003、87、4 01、603、5觀察各管產(chǎn)生得混濁并

12、根據(jù)混濁度來判斷酪蛋白得等電點.觀察時可用 +,+,+ ,表示渾濁度。3、蛋白質(zhì)性質(zhì)實驗(1)蛋白質(zhì)得鹽析白色渾濁產(chǎn)生。滴加過程中不要搖動試管，現(xiàn)象不明顯時，多加幾滴硫酸銨飽與溶液。(2)蛋白質(zhì)得變性在試管里加入2毫升蛋白質(zhì)得水溶液,沸水浴加熱5分鐘，觀察現(xiàn)象。把試管里得下層物質(zhì)取出一些放在水里，觀察現(xiàn)象。在試管里加入3毫升蛋白質(zhì)得水溶液，加入1毫升硫酸銅溶液，觀察現(xiàn)象.(有無淡藍色在試管里加入12毫升蛋白質(zhì)得水溶液，然后逐滴加入硫酸銨飽與溶液，觀察現(xiàn)象，有無絮狀渾濁沉淀產(chǎn)生).把少量沉淀放入盛有蒸餾水得試管里，觀察沉淀就是否溶解.五、思1、在等電點時蛋白質(zhì)得溶解度為什么最低？請結(jié)合您得實驗結(jié)果與蛋白質(zhì)得膠體性質(zhì)加以說明。在等電點時，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負(fù)電荷相等),此時蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷得相互排斥，分子相互之間得作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉淀物.2、本實驗中，酪蛋白