貴州不同產(chǎn)地魚腥草不同部位綠原酸的高效液相色譜測(cè)定

1、貴州不同產(chǎn)地魚腥草不同部位綠原酸的高效液相色譜測(cè)定                 作者：楊占南， 羅世瓊，彭全材，余正文，朱國勝，楊衛(wèi)平【摘要】目的建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確測(cè)量魚腥草中綠原酸含量的方法。方法對(duì)魚腥草根、莖、葉的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果根在30%乙醇濃度條件下，超聲25min為提取綠原酸最佳效果；莖在40%乙醇濃度條件下，25min為提取綠原酸最佳效果；葉在40%乙醇濃度條件下，20min為提取綠原酸最佳效果。結(jié)論不同產(chǎn)地的魚腥草中

2、綠原酸的含量差異較大以及不同部位的魚腥草中綠原酸含量差異很大，為評(píng)價(jià)其資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】   高效液相色譜法； 檢測(cè)； 魚腥草； 綠原酸Abstract：ObjectiveTo develop a fast, accurate, useful and convenient method for the determination of chlorogenic acid from different organs of Houttuy cordata Thunb. MethotdsChlorogenic acid was extracted from roots, s

3、tems, and leaves of the H. cordata .Results The experimental conditions were optimized and the results showed that the best conditions, obtained by preliminary test, were roots: 30% ethanol and 25min ultrasonic extraction, stem: 40% ethanol and 25min ultrasonic extraction, and leaves: 40% ethanol an

4、d 20min ultrasonic extraction. Chlorogenic acid in different fractions of Houttuy Cordata Thunb collected in various areas in Guizhou.Condusion The results showed that the contents of chlorogenic acid were different from various areas, and the contents of chlorogenic acid were also different from di

5、fferent organs of H. cordata.Therefore, data were provided for exploiture of resource.Key words：HPLC;  Determination;  Houttuy cordata Thunb;  Chlorogenic acid魚腥草Houttuynia cordata Thund.又名蕺菜、側(cè)耳根等，屬三百草科(Saururaceae)蕺菜屬(Houttuynia Thunb.), 因全草帶魚腥味而得名1。原產(chǎn)我國，分布于長江以南廣大省區(qū)，生于背陽山地、林邊、田埂及洼地草叢

6、中2。全草富含揮發(fā)油、魚腥草素、刺激性蕺菜堿及鉀鹽3。魚腥草藥用價(jià)值很高，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿涌淋作用，還可以提高人體的免疫力4。據(jù) 中國 藥典記載，魚腥草可治肺炎、腸癰、痢疾、支氣管炎、尿路感染、瘡癤癰腫等癥5，同時(shí)有很高的食用價(jià)值，富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素C、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，維生素含量特別高6，7，是一種營養(yǎng)價(jià)值極高的野生蔬菜，目前已有人工栽培，已成為一種高檔蔬菜8。福建、云南、四川、貴州、廣東等地開發(fā)利用魚腥草的規(guī)模不斷擴(kuò)大，野生資源供不應(yīng)求，開發(fā)利用前景廣闊。魚腥草是多年生草本植物，野生 自然 狀態(tài)下高約30 cm。地下莖節(jié)上生根，葉互生卵形，基出五脈，葉柄基

7、部鞘狀抱莖?；ㄐ?，淡黃色或白色，穗狀花序頂生，果近球形9。對(duì)魚腥草的有效成分、藥理作用和的研究表明其生物活性較高10，由于它既克服了西藥的弊端又具有抗菌和抗病毒的持久性，同時(shí)資源豐富，使用安全，其臨床應(yīng)用的前景樂觀，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。綠原酸(chlorogenic acid，CA)是一種多酚類化合物，由一分子咖啡酸和一分子奎尼酸縮合脫水而成，是植物界廣泛存在的一類次生代謝物質(zhì)，我們運(yùn)用ChemDraw分別構(gòu)建了綠原酸的分子結(jié)構(gòu)同時(shí)使用Chem3D 軟件模擬了其3D構(gòu)象（1）。研究表明，綠原酸具有抗菌、消炎、解毒、利膽、降壓和升高白細(xì)胞及顯著增加胃腸蠕動(dòng)和促進(jìn)胃液分泌等藥理作用11，12，對(duì)大

8、腸桿菌、金色葡萄球菌、肺炎球菌和病毒有較強(qiáng)的抑制作用13；對(duì)急性咽喉炎癥和皮膚病有明顯療效，臨床上用于 治療 急性細(xì)菌性感染疾病及化療時(shí)所致的白細(xì)胞減少癥，對(duì)月經(jīng)過多，子宮功能性出血有良好的止血效果14。除了藥用外，綠原酸還可用作抗氧化劑而應(yīng)用于食品 工業(yè) 。綠原酸的測(cè)定方法，主要報(bào)道的是金銀花和杜仲藥材上，采用的方法主要是液相色譜法15，也有 文獻(xiàn) 用毛細(xì)管電泳法測(cè)定16。魚腥草中的綠原酸的測(cè)定，主要是對(duì)魚腥草制品或制劑中的含量測(cè)定，由于制劑中的綠原酸是經(jīng)過提取加工的，樣品中的干擾成分簡單，較容易提取，因此，有大量的報(bào)道17,18，但是對(duì)于魚腥草藥材中綠原酸的含量分析，報(bào)道的比較少，據(jù)我們的

9、現(xiàn)有知識(shí)，僅見一篇文獻(xiàn)報(bào)道了用紫外分光光度計(jì)測(cè)定魚腥草中綠原酸的含量19。高效液相色譜法分析魚腥草中綠原酸的含量未見文獻(xiàn)報(bào)道。目前，人們開始對(duì)中藥藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有新的認(rèn)識(shí)，中藥質(zhì)量控制首先考慮中藥材的質(zhì)量控制。因此，藥材中藥用成分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也顯得非常重要。本文主要對(duì)不同產(chǎn)地魚腥草的不同部位中綠原酸的含量進(jìn)行分析，通過對(duì)綠原酸提取條件的優(yōu)化以及色譜條件的選擇，建立測(cè)定魚腥草中綠原酸含量測(cè)定的方法，并通過此方法，對(duì)貴州不同產(chǎn)地魚腥草不同部位的綠原酸含量進(jìn)行分析，探討魚腥草不同產(chǎn)地和不同部位綠原酸的含量變化關(guān)系，以期為更好地利用和開發(fā)魚腥草提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1  藥品與儀器 1.1

10、60; 藥品甲醇(色譜純)；超純水；無水乙醇(分析純)；綠原酸對(duì)照品（購于中國生物制品研究所）。1.2  儀器島津高效液相色譜儀（LC-20AT）；20l進(jìn)樣閥；二級(jí)陣列管檢測(cè)器（PDA-20AT）；島津色譜站（LCsolution）；藥材粉碎機(jī)；超純水器(美國Milli2 pore公司)；色譜條件：迪馬C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5m)；美國ELMA T660/H超聲波清洗器(功率360W，頻率35 kHz)。 2  方法與結(jié)果 2.1  樣品的采集與處理從貴陽、遵義、銅仁、都勻等地采集魚腥草（來源見表 1），將其根、莖、葉分開，清洗

11、好后放入恒溫箱烘干（50），用打粉機(jī)將各部分分開打磨成粉末（80目），分裝到不同的袋子中備用，在各個(gè)袋子上貼上標(biāo)簽，注明其內(nèi)容物的來源地以及部位。表1  魚腥草樣品的來源及生長（略）2.2  色譜條件流動(dòng)相：乙腈:0.1%磷酸溶液=4:6(V/V)；流速為1.0ml/min；柱溫40； 進(jìn)樣量20l；檢測(cè)波長327nm；以色譜峰面積定量。在此條件下，測(cè)得綠原酸的保留時(shí)間在7.3min 左右，樣品溶液中主峰和其它雜峰達(dá)到完全分離如圖2。         2.3  提取條件的優(yōu)化2.3.1

12、  不同濃度的乙醇提取稱取10份魚腥草樣品每份1.000g（精確到1mg），分別加入不同濃度的乙醇（20ml）稱重，超聲40min后，稱重補(bǔ)足重量損失，離心，取上清液，過0.45m的微孔濾膜，供上機(jī)待測(cè)，測(cè)定不同乙醇濃度下所提取綠原酸的含量。在不同的乙醇濃度下提取所得的綠原酸峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，以不同濃度乙醇橫坐標(biāo)作（見圖 3）。2.3.2  不同時(shí)間提取稱取7份魚腥草樣品，每份1.000g（精確到1mg）編號(hào)為1，2，3，4，5，6，7號(hào)，在分別加入40%的乙醇（20ml）稱重，分別超聲5，10，15，20，25，40，60min后，稱重補(bǔ)足重量損失，離心，取上清液，過

13、0.45m的微孔濾膜，供上機(jī)待測(cè)，測(cè)定不同時(shí)間所提取的綠原酸在色譜中的響應(yīng)值。在不同時(shí)間下提取所得的綠原酸峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，以不同時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖（見圖4）。2.4  精密度與穩(wěn)定性試驗(yàn)取濃度為40.5g/ml的對(duì)照品溶液20l，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)5次，依據(jù)所得峰面積， 計(jì)算 RSD為0.197%；取甕安家生根供試品溶液，分別在2，4，8，16，24h 進(jìn)樣，依據(jù)所得峰面積，計(jì)算RSD為2.768%。結(jié)果表明，供試品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密度和穩(wěn)定性色譜疊加見圖5。2.5  線性關(guān)系考察分別精密吸取綠原酸對(duì)照品濃度為8.1，16.2，24.3，32.4，40.5

14、 g/ml溶液20 l，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行測(cè)定，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以綠原酸的量（g/ml）為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，計(jì)算回歸方程， 綠原酸的回歸方程為：Y=83 203X + 18 242，相關(guān)系數(shù)：R=0.9995，線性范圍為：0.1620.810 g。不同濃度的綠原酸對(duì)照樣品的疊加見圖6。2.6  加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取甕安家生魚腥草根樣品9 份, 每份1.00 g, 3 份為一水平, 分別精密加入“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0.5，2，8 ml綠原酸對(duì)照品,按供試品溶液制備項(xiàng)下處理, 在“2.2”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行分析, 結(jié)果綠原酸的平均回收率93.13%, R

15、SD為3.75%。2.7  樣品溶液的制備精密稱取樣品粉末1 g左右，置于25 ml容量瓶中，根用30%的乙醇溶液，莖、葉用40%的乙醇溶液定容, 塞緊，超聲提取25 min， 靜置，取上清液用微孔濾膜過濾，濾液待測(cè)。分別精密稱取24個(gè)批號(hào)的魚腥草粉末，按上述供試品溶液的制備方法和色譜測(cè)定條件，測(cè)定與魚腥草各部位綠原酸的含量。結(jié)果見表2。表2  魚腥草樣品中綠原酸的含量（略） 3  討論本實(shí)驗(yàn)利用超聲波效應(yīng)提取魚腥草中的綠原酸，采取不同的乙醇濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在30%的乙醇濃度下魚腥草根中綠原酸提取效率最高，莖和葉在40%乙醇濃度條件下綠原酸提取最高；同

16、時(shí)，對(duì)超聲提取時(shí)間因素進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，魚腥草根和莖在25 min提取綠原酸為最佳，魚腥草葉在20 min提取綠原酸為最佳。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提取綠原酸的最佳條件是：根在30%乙醇濃度條件下，超聲25 min為提取綠原酸最佳效果；莖在40%乙醇濃度條件下，25 min為提取綠原酸最佳效果；葉在40%乙醇濃度條件下，20 min為提取綠原酸最佳效果。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定魚腥草中綠原酸的含量，方法簡便易行，結(jié)果靈敏、準(zhǔn)確、可靠，可為魚腥草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)，具有推廣價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)貴州不同地區(qū)的魚腥草綠原酸含量進(jìn)行分析，并將魚腥草的根、莖、葉部分分開處理，比較其含量的不同。

17、從圖7結(jié)果表明：同一地的魚腥草不同部位的綠原酸含量有很大的差異，不同產(chǎn)地的魚腥草中綠原酸的含量差異很大；產(chǎn)地不同導(dǎo)致的綠原酸含量的差異，主要因?yàn)槭軞夂?、土壤、光照等各種因素的影響；不同地區(qū)魚腥草各部位綠原酸的含量也不相同。從魚腥草各部位綠原酸含量來看，魚腥草中綠原酸的含量為：根莖和葉。從不同的地區(qū)來看；遵義地區(qū)根的綠原酸含量最高，其次是都勻地區(qū)，兩者都明顯高于銅仁地區(qū)和貴陽地區(qū)。通過本研究證明，魚腥草的各部分都具有很高的利用價(jià)值。據(jù)調(diào)查，很多地方食莖不食葉,原因可能是葉的口感不好，但葉也有很大的利用價(jià)值，故可將葉進(jìn)行加工利用，制成保健食品或飲品。有關(guān)魚腥草葉的利用還有待進(jìn)一步研究?！?參考 文

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