RPV6在人參二醇組皂苷(PDS)減輕LPS休克腦損傷中表達(dá)的變化及意義

1、RPV6在人參二醇組皂苷(PDS)減輕LPS休克腦損傷中表達(dá)的變化及意義    【摘要】     目的 通過(guò)觀(guān)察人參二醇組皂苷(PDS)對(duì)TRPV6蛋白的影響，探討PDS對(duì)LPS誘導(dǎo)休克時(shí)腦損傷的保護(hù)機(jī)制。方法 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS休克(LPS)組、地塞米松(LPS+Dex)組、PDS低劑量(LPS+PDSL)組、PDS中劑量(LPS+PDSM)組及PDS大劑量(LPS+PDSH)組。大鼠靜脈注射LPS(4 mg/kg)4 h后，觀(guān)察各組大鼠生存期，計(jì)算生存率，Western Blot檢測(cè)大腦皮質(zhì)

2、中TRPV6和Bcl2的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，LPS組大鼠生存率降低達(dá)50%，腦皮質(zhì)中TRPV6的蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bcl2/Bax蛋白表達(dá)的比值降低;而與LPS組相比，LPS+Dex組和LPS+PDS各組大鼠生存率增加，腦皮質(zhì)中TRPV6的蛋白表達(dá)水平明顯增高，Bcl2/Bax比值也增高。 結(jié)論 PDS減輕LPS誘導(dǎo)的腦損傷，可能與上調(diào)腦皮質(zhì)中TRPV6蛋白有關(guān)。     【關(guān)鍵詞】  脂多糖(LPS)，人參二醇組皂苷(PDS)，TRPV6，Bcl2，Bax    Protective ef

3、fect of panaxadiols against brain injury induced by LPS through upregulating TRPV6WANG Hao, ZHONG JiaTeng, LIU Ning, et al.The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China【Abstract】 Objective To explore the protective effect of panaxadiols (PDS) on brain injury induced by lipop

4、olysaccharides (LPS) and its mechanism. Methods Rats were divided into control, LPS, LPS + dexamethasone (DEX) and LPS + PDS low, middle and high dose groups randomly. Survival rate of rats in every group was calculated. The expressions of TRPV and BCL2 were detected by Western blot. Results Compare

5、d with control group, survival rate of LPS group was decreased, the expression of TRPV6 and BCL2/BAX protein ratio were decreased. Compared with LPS group, survival rates of LPS+DEX group and LPS+PDS groups were increased，and the expressions of TRPV6 protein and BCL2/BAX protein ratios were also upr

6、egulated in LPS+Dex group and all LPS+PDS groups. Conclusions The effect of PDS against brain injury induced by LPS may be related with upregulating TRPV6 protein.【Key words】 Lipopolysaccharides (LPS); Panaxadiols (PDS); TRPV6; BCL2; BAX 內(nèi)毒素(endotoxin) 存在于革蘭陰性細(xì)菌(G-)細(xì)胞壁外膜中,其主要生物活性成分為脂多糖(lipopolysacch

7、aride,LPS),在內(nèi)毒素休克的發(fā)病機(jī)制中具有十分重要的作用。已有研究表明，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子與顱腦損傷之間有密切關(guān)系1;鈣穩(wěn)態(tài)在細(xì)胞凋亡中起重要作用2。鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Ca2+ transport protein，CaT1/TRPV6)1999年從人的小腸中克隆，屬于TRPV家族，是細(xì)胞膜上調(diào)控細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的主要鈣通道之一3，TRPV6的活性與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)4。已有研究表明人參二醇組皂苷(PDS)能減輕LPS休克腦損傷5。本研究的目的是通過(guò)復(fù)制LPS休克大鼠模型，觀(guān)察TRPV6在PDS減輕LPS誘導(dǎo)的腦損傷時(shí)的作用，進(jìn)一步探討LPS對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的可能作用機(jī)制。1 材料與方

8、法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 健康Wistar大鼠(由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室提供)48只，體重(250±10)g，雌雄不限，隨機(jī)分為6組(每組8只)：對(duì)照組、LPS休克(LPS)組、地塞米松(LPS+Dex)組、PDS低劑量(LPS+PDSL)組、PDS中劑量(LPS+PDSM)組、PDS高劑量(LPS+PDSH)組。實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)5進(jìn)行。1.2 腦皮質(zhì)蛋白的提取 稱(chēng)取100 mg腦皮質(zhì)，加入1 ml組織蛋白提取液，用電動(dòng)勻漿器冰浴上充分勻漿。2 000 r/min，4離心20 min，棄沉淀，取上清。12 000 r/min，4離心10 min，上清即為總蛋白。BioRad法測(cè)定蛋

9、白含量。1.3 Western印跡檢測(cè)TRPV6、Bcl2和Bax蛋白的表達(dá) 各組取蛋白25 g 與5×上樣緩沖液250 mmol/L TrisHCl(pH6.8)，10%SDS，0.5%溴芬藍(lán)，50%甘油，5%巰基乙醇混合，100變性5 min，進(jìn)行SDSPAGE電泳分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移到PVDF轉(zhuǎn)移膜上。PVDF膜經(jīng)漂洗、封閉后各加入稀釋度為1200 的兔抗TRPV6、Bcl2和Bax多克隆抗體，4，過(guò)夜。然后各加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，稀釋度為1500，室溫孵育2 h 。經(jīng)PBST洗滌，DAB顯色。用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)各條帶的吸光度值進(jìn)行定量分析。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果

10、以x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,各組之間各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)比較采用t檢驗(yàn)。2 結(jié) 果2.1 4 h存活率 觀(guān)察各組大鼠生存期并計(jì)算生存率，LPS組4 h存活率是對(duì)照組的50%(P<0.05)，LPS+Dex組是對(duì)照組的80%(P<0.05)。2.2 PDS對(duì)LPS休克腦皮質(zhì)中TRPV6 蛋白變化的影響 與對(duì)照組相比，LPS組腦皮質(zhì)中TRPV6的蛋白表達(dá)水平明顯降低，而與LPS組相比，LPS+Dex組和LPS+PDS組腦皮質(zhì)中TRPV6的蛋白表達(dá)水平明顯增高，其中LPS+PDSM組明顯增高，如圖1。1.對(duì)照組;2.LPS組;3.LPS+DEX組;4.LPS+

11、PDSL組;5.LPS+PDSM組;6.LPS+PDSH組，下圖同圖1 各組大腦皮質(zhì)TRPV6的蛋白表達(dá)2.3 PDS對(duì)LPS休克腦皮質(zhì)中BCL2,BAX蛋白表達(dá)的影響 Western印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組腦皮質(zhì)中Bcl2/Bax的比值下降;與LPS組相比，LPS+Dex組和LPS+PDS組腦皮質(zhì)中，Bcl2/Bax的比值升高，其中LPS+PDS中劑量組的Bcl2/Bax比值明顯增加，如圖2。圖2 各組腦皮質(zhì)Bcl2/Bax的蛋白表達(dá)3 討 論鈣離子(Ca2+)在細(xì)胞的生命活動(dòng)中具有重要作用，所有類(lèi)型細(xì)胞的各種功能均不同程度地被鈣離子調(diào)控。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度處于嚴(yán)格的調(diào)節(jié)控制之中，

12、以維持細(xì)胞的重要生理功能。但這種巨大的鈣離子濃度梯度也使細(xì)胞處于一種永恒的危險(xiǎn)境地，易于受到許多因素的作用，從而影響鈣信號(hào)調(diào)控作用，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，嚴(yán)重時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞損傷或凋亡6，7。目前的研究結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)定似乎起著更為重要的作用，不管是升高還是降低，打破這種穩(wěn)態(tài)就可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞膜鈣離子通道對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)定起著十分重要的作用8。研究發(fā)現(xiàn)Bcl2還有調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體的功能，它能抑制線(xiàn)粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì),如細(xì)胞色素C(CytC)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)。胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Bcl2蛋白控制Ca2+離子流,影響胞內(nèi)Ca2+重新分布,人們發(fā)現(xiàn)凋亡與Ca2+流從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入

13、胞質(zhì)有關(guān),且Bcl2能阻斷這種鈣流9;Bax通過(guò)作用于線(xiàn)粒體而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Bax分布于線(xiàn)粒體外膜上,引起線(xiàn)粒體膜通透性改變及MPT孔開(kāi)放,可允許相對(duì)低分子量的物質(zhì)，包括Ca2+自由通過(guò)線(xiàn)粒體膜,引起細(xì)胞凋亡10。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，大鼠單獨(dú)注射LPS 4 h后，生存率降低，TRPV6蛋白表達(dá)明顯降低，這提示，大腦皮質(zhì)TRPV6蛋白表達(dá)水平的降低，進(jìn)而影響胞內(nèi)鈣離子濃度穩(wěn)態(tài)，而且Bcl2/Bax蛋白表達(dá)水平的比值明顯降低，不能抑制鈣內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。與LPS組相比，LPS+Dex組和LPS+PDS組TRPV6明顯升高，而且Bcl2/Bax蛋白表達(dá)水平的比值明顯增高，有抑制細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流

14、的可能，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而抑制凋亡，這些與大鼠生存率增高有關(guān)。以上結(jié)果表明，LPS+PDS組和LPS+Dex組TRPV6蛋白的表達(dá)均明顯高于LPS組，這可能與PDS及地塞米松對(duì)內(nèi)毒素休克腦組織的具有一定的保護(hù)作用有關(guān)。    【參考文獻(xiàn)】  1 薛 文,李守緘.創(chuàng)傷性腦損傷后鈣超載機(jī)制的研究進(jìn)展J.臨床醫(yī)藥實(shí)踐雜志 2008;17(5):3214.2 張 瑜,常 明,韓 威,等.鈣激活蛋白酶與蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制J.中國(guó)老年學(xué)雜志，2008;28(1):268.3 Bdding M，F(xiàn)lockerzi V.Ca2+Depen

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