人參皂苷Rg1對癡呆大鼠行為學及酪氨酸蛋白激酶A表達的影響

1、人參皂苷Rg1對癡呆大鼠行為學及酪氨酸蛋白激酶A表達的影響        【摘要】     目的 探討人參皂苷Rg1對癡呆模型大鼠學習記憶能力的影響及其對酪氨酸蛋白激酶A(TrkA)陽性細胞的保護作用。方法 采用切斷成年Wistar 大鼠左側穹窿海馬傘（FF）的方法，建立隔海馬膽堿能系統(tǒng)損害的癡呆模型。分為模型組、治療組和假手術對照組3組。治療組經腹腔內注射Rg1(5 mg·kg-1)，模型組和假手術對照組給予生理鹽水。利用Morris水迷宮測定其學習記憶

2、能力，利用免疫組化及圖像分析測定大鼠內側隔核(MS) 和斜角帶垂直支(VDB) TrkA 陽性細胞數及OD值。結果 治療組大鼠的學習記憶成績優(yōu)于模型組（P005），其MS和VDB的TrkA 陽性細胞數及OD值與模型組相比也有改善（P005）。結論 人參皂苷Rg1對中樞膽堿能系統(tǒng)有保護作用，能改善學習記憶能力。     【關鍵詞】  人參皂苷Rg1TrkA穹隆海馬傘    現代藥理學研究表明,人參皂苷具有抗衰老、增強記憶力等作用,張均田等1研究發(fā)現,人參皂苷Rg1對多種實驗動物模型的學習記憶障礙均有明顯的改

3、善作用,但少見人參皂苷Rg1對穹隆海馬傘切斷造成癡呆模型大鼠腦內神經生長因子受體影響的報道，本研究用切斷左側穹隆海馬傘建立大鼠癡呆模型，經人參皂苷Rg1治療一個月后觀察內側隔核(MS) 和斜角帶垂直支(VDB)TrkA 陽性細胞數及OD值，探討人參皂苷Rg1對呆模型大鼠的保護作用。1  材料與方法11  試驗動物  用水迷宮篩選反應迅速、活躍的40只健康雄性Wistar 大鼠，鼠齡34個月，體重250300 g，常規(guī)飼養(yǎng)。12  主要試劑及藥品  兔抗鼠TrkA多克隆抗體購自博士德公司。人參皂苷單體Rg1 (含量 98%)購自白求恩醫(yī)科大學有機

4、化學實驗室。13  主要儀器  腦立體定位儀(日本);Morris水迷宮(中國醫(yī)科院藥物所研制)，TJY400真彩色細胞圖像分析儀。14  方法141  動物分組與模型建立  采用完全單純隨機分為3組（每組10只），即模型組、治療組和假手術對照組。    實驗動物用10%水合氯醛3 ml/kg經腹腔麻醉后,固定在腦立體定位儀上,常規(guī)剪毛、消毒,正中切開頭皮，暴露出顱骨，參照Paxinos和Watson的大鼠腦立體定位圖譜2,于前囟后2225 mm，中線外10 mm 處,用電動開顱器鉆開顱骨,切開硬腦膜,用自制雙刃刀

5、先置于上述部位的腦表面,接著降刀45 mm,外移10 mm，然后再降刀10 mm，外移15 mm，最后上下抽動刀約20 次,以保證海馬傘外側緣完全切斷。清潔顱面,縫合頭皮,常規(guī)飼養(yǎng)3，4。假手術組除了不切斷海馬傘外,其余處理同上。142  給藥方法  Rg1治療組：左側穹隆海馬傘切斷后,同時給予腹腔內注射Rg1(5 mg/kg),每天1次,連續(xù)注射30 d。模型組和假手術對照組每天腹腔內注射生理鹽水1 ml,連續(xù)30 d。143  行為學測試  各組分別于模型制作前及術后30 d均進行orris水迷宮行為學測試。測試時實驗室的溫度保持在2425，orri

6、s水迷宮中加入奶粉1 kg,用熱水沖開,再用水加至高過安全平臺1 cm,水溫保持在22左右。奶粉水溶液中不能明顯見到安全平臺。水池四周存在豐富的空間參考線索（門、窗、燈、試驗者等），應保持不變以供大鼠定位平臺。水池上方通過一攝像機與監(jiān)視電視和計算機連接,利用計算機軟件對動物的活動進行全程跟蹤,自動錄入大鼠游泳軌跡進行分析。測試程序為定位航行實驗：歷時4天，每天上下午各2次，將動物頭朝壁分別從4個入水點放入水中，記錄其在3 min內尋找到并爬上平臺的時間即逃避潛伏期。如果大鼠在3 min未找到平臺，潛伏期記為最高分180 s。術后30 d各組大鼠重新進行游泳實驗，大鼠每次在3 min內尋找到并爬

7、上平臺的時間為大鼠的再現記憶成績，每天2次，連續(xù)4 d，計算平均成績。143  標本制作及觀察  所有大鼠在建立模型后30 d麻醉大鼠，暴露心臟,先以生理鹽水200 ml經升主動脈沖洗,再灌注4多聚甲醛200 ml固定,取腦備用。腦組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋,每只鼠在靶區(qū)附近連續(xù)切片，片厚為45 m，備免疫組化之用。(每只大鼠取含典型內側隔核(MS) 和斜角帶垂直支(VDB) 切片5 張，切片的斷面水平在各鼠均相似。)145  免疫組化分析  切片經脫蠟、阻斷、封閉后加入TrkA 抗體(1200，博士德公司),4 過夜,或37 孵育1 h，001

8、 mol/L 的PBS 漂洗3次,每次10 min，LK 入生物素化兔二抗(博士德公司)孵育20 min，001 mol/L PBS 溶液漂洗3 次，每次10 min，加入鏈霉素抗生物素過氧化物酶孵育30 min，001 mol/L PBS 溶液漂洗3 次,每次10 min，蒸餾水快洗3 次。DAB法顯色,鏡下控制時間,蒸餾水終止反應,干燥、脫水、透明、封片,光鏡觀察。陰性對照用001 mol/L PBS 代替一抗,其余步驟相同。15  數據獲取與統(tǒng)計學分析  參考Paxinos和Watson編寫的大鼠腦圖譜2,光學顯微鏡下觀察左側內側隔核(MS) 和斜角帶垂直支(VDB)

9、TrkA 陽性細胞的數量，每張切片隨機各取5個視野記錄,計算平均單個視野中TrkA陽性細胞的數量。然后輸入圖像分析儀，對所選陽性細胞的灰度值進行測量，求出每組陽性細胞胞體的平均灰度值，然后做統(tǒng)計學分析。    數據用SPSS110 軟件處理，實驗數據以x±s表示。同組大鼠逃避潛伏期在干預前、后的比較用配對t檢驗，干預前、后各組大鼠間逃避潛伏期的比較用單因素方差分析加Tukey 兩兩比較。各組大鼠MS 和VDB 的TrkA 陽性細胞數及OD值的比較用單因素方差分析加Tukey 兩兩比較。2  結果21  人參皂苷Rg1對FF損傷大鼠學習

10、記憶的影響  以大鼠逃避潛伏期代表學習記憶能力，逃避潛伏期越短，大鼠的學習記憶能力越強。模型組大鼠與假手術對照組相比潛伏期延長（P005）；治療組較模型組潛伏期減少（P005），但沒有達到假手術對照組的水平（P005）。這表明人參皂苷Rg1能夠改善癡呆模型鼠的學習記憶能力（見表1）。表1  治療前、后各組大鼠Morris水迷宮測試成績（略）與模型組比較：1）P005；與假手術對照組比較：2）P005；與假手術對照組比較：3）P005，下表同22  人參皂苷Rg1對FF損傷后MS和VDB的TrkA陽性神經元數目及OD值的影響  假手術組大鼠MS和VDB區(qū)有

11、基礎水平的TrkA 表達。模型組與假手術組比較，MS和VDB區(qū)TrkA 陽性細胞數值明顯減少,OD值明顯增高(P005) 。治療組MS和VDB區(qū)TrkA 陽性細胞數值明顯高于模型組（P005），但是沒有達到假手術對照組的水平（P005），（見表2）。表2  藥物對大鼠MS和VDB的TrkA陽性神經元數(個/視野)及OD值的影響（略）3  討論    基底前腦廣泛向大腦皮質、海馬和其他一些結構投射，形成前腦膽堿能系統(tǒng)。Alzheimer病基底前腦膽堿能神經元發(fā)生嚴重潰變，導致皮質和海馬的膽堿能纖維支配減少及膽堿乙酰化酶活性降低，并出現學習記憶能力

12、障礙。單側切斷穹隆海馬傘造成隔海馬膽堿能通路損害是模擬AD前腦膽堿能系統(tǒng)受損的一個經典模型4。本實驗大鼠行為學證實造模成功。前腦膽堿能神經元是NGF 敏感神經元,它們含有大量NGF 受體，多數人的研究結果都提示AD 病人基底前腦膽堿能神經元功能喪失與NGF 受體減少密切有關5，6。Boissiere等7用免疫組化方法檢測人基底前腦，發(fā)現基底前腦中有99的膽堿能神經元同時表達TrkA。目前的研究提示，在正常鼠的腦中TrkA 和ChAT 有相似的時空模式，認為TrkA 和ChAT 表達下降是老年動物和老年癡呆患者基底前腦膽堿能神經元變性的易感性增加的原因之一8。在基底前腦表達TrkA mRNA 的

13、膽堿能纖維廣泛地投射到海馬和新皮質9。本研究發(fā)現左側穹隆海馬傘切斷后，MS和VDB的TrkA陽性神經元數明顯減少，證明TrkA陽性神經元數減少可以作為老年性癡呆模型檢測指標。    人參皂苷Rg1是人參的標志性成分，具有人參的許多生物活性，研究表明，人參皂苷Rg1能通過促進腦內蛋白質合成起到促智、抗衰老的作用。神經營養(yǎng)因子對神經元的大多數效應是由Trk 受體介導的,包括神經元的存活、分化、軸突生長、突觸可塑性等。其中N GF 與TrkA 結合,可激活酪氨酸激酶信號傳遞系統(tǒng),從而啟動細胞活性,產生生物效應10。已證明NGF 能有效防止模擬AD 病變的動物基底前腦膽堿

14、能神經元變性和死亡。但是NGF 分子量大，口服或注射難以達到大腦，造成治療上的困難。本實驗應用人參皂苷Rg1 腹腔內注射治療單側切斷穹隆海馬傘造成隔海馬膽堿能通路損害的AD大鼠模型。結果顯示人參皂苷Rg1能明顯保護基底前腦TrkA陽性神經元。應用小分子化合物人參皂苷Rg1在體內促進TrkA神經元增加，克服以往研究中NGF不能通過血腦屏障的缺點，提示人參皂苷Rg1在體內可能通過兩個途徑改善癡呆模型：1、促進膽堿能神經元TrkA表達，增加NGF 與TrkA 結合機會，從而激活酪氨酸激酶信號傳遞系統(tǒng),從而啟動細胞活性,產生生物效應。2、促進腦內N GF表達代替外源性N GF的作用達到治療AD的作用。

15、后一推測有待今后研究中更直接的證據進一步證明。我們認為人參皂苷Rg1 是治療以認知障礙和學習記憶下降為主要表現的AD 候選藥物。    【參考文獻】  1 張均田人參研究的回顧和展望J藥學,1995；30(5):32152 Paxinos G，Watson CThe rat brain in stereotaxic coordinatedMAustralia：Academic Press Australia,1988：233 He YS，Yao ZBNGF promotes collateral sprouting fiber in the s

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