乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Galectin3、OPN的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義

1、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Galectin3、OPN的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義                  作者：余慧萍，樊祥山，孟凡青，張東生，周強(qiáng)，吳鴻雁，孟奎【摘要】  目的： 檢測Galectin3和骨橋蛋白(OPN)在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(IDC)中的表達(dá)情況，并探討其在IDC進(jìn)展過程中的意義。方法： 應(yīng)用組織芯片技術(shù)和免疫組化法研究100例乳腺IDC和35例乳腺良性病變中G

2、alectin3、OPN的表達(dá)情況，并統(tǒng)計(jì)分析其與年齡、腫瘤最大直徑、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間關(guān)系。結(jié)果： Galectin3在乳腺IDC和良性病變中的表達(dá)強(qiáng)度具有明顯差異(2=47.814，P=0.000)，OPN在二者中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在IDC組, Galectin3表達(dá)強(qiáng)度與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)關(guān)系(分別為：rs=0.300，P=0.002;rs=0.335，P=0.001)，與年齡、腫瘤最大直徑、組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; OPN的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤最大直徑、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)(分別為：rs=0.236，P

3、=0.018;rs=0.389，P=0.000;rs=0.404，P=0.000)，與年齡、組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Galectin3與OPN的表達(dá)也呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.266，P=0.007)()。結(jié)論： Galectin3在乳腺良、惡性病變中的表達(dá)水平具有明顯差異，在乳腺病變中檢測Galectin3的表達(dá)對(duì)病變性質(zhì)的判斷具有重要意義;高表達(dá)Galectin3、OPN的乳腺IDC具有更高侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力，對(duì)二者作用機(jī)制的深入研究有可能使其成為乳腺IDC患者個(gè)體化治療的新靶點(diǎn)。 God defend me from my friends; form my e

4、nemy I can defend myself.  【關(guān)鍵詞】  乳腺腫瘤;浸潤性導(dǎo)管癌;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移; Galectin3;骨橋蛋白Galectin3 是一種半乳糖苷結(jié)合蛋白, 具有影響細(xì)胞黏附12、抗凋亡3、促進(jìn)腫瘤微血管發(fā)生4等作用，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種分泌型鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白，近年來，OPN與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，特別是與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系日益引起人們的關(guān)注，其在許多人類腫瘤組織中過表達(dá)，被公認(rèn)為是與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。目前二者在乳腺癌方面的相關(guān)研究還較少，因此我們希望通過組織芯片

5、技術(shù)進(jìn)一步研究人類乳腺癌組織中這兩種蛋白的表達(dá)情況及其臨床病理學(xué)意義。A clear conscience is a sure card.  1 材料與方法Children and fools cannot lie.  1.1 標(biāo)本來源收集南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院2002年6月至2006年5月間存檔的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(IDC)標(biāo)本共計(jì)104例，患者年齡2880歲，中位年齡49歲，平均年齡51.32歲;另收集該院2006年1月至2006年12月期間乳腺良性增生41例(纖維腺瘤30例，腺病11例)。所有病例術(shù)前均未行放、化療, 臨床資料完整，標(biāo)本

6、均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)處理后石蠟包埋。1.2 主要試劑和儀器One cannot get blood from a stone.  Galectin3兔抗人多克隆抗體工作液及OPN鼠抗人單克隆抗體工作液均購自北京中杉公司，組織微陣列打孔系統(tǒng)購自美國Beecher公司，組織芯片載體采用德國MenzelGlaser Super Frost Plus玻片(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。1.3 組織芯片制備和免疫組織化學(xué)染色The peacock has fair feathers, but foul.  所有病例經(jīng)復(fù)診并根據(jù)HE切

7、片標(biāo)記出典型病變范圍后，應(yīng)用組織微陣列打孔儀在每例組織典型病變處取樣，分別移植至受體蠟塊上，制成乳腺病變組織芯片蠟塊;按同樣方法構(gòu)建另一個(gè)包含相同病例且陣列設(shè)計(jì)相同的組織芯片蠟塊以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)重復(fù);分別連續(xù)4m切片，制備成組織芯片備用。對(duì)組織芯片進(jìn)行Envision 二步法免疫組織化學(xué)染色，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，每個(gè)檢測指標(biāo)均在另一張組織芯片上重復(fù)1次。1.4 結(jié)果判定None but a wise man can employ leisure well.  Galectin3及OPN陽性部位在細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)黃色顆粒且染色強(qiáng)度高于背景非特異性著色者為陽性細(xì)胞。綜

8、合考慮染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)：無染色(-)，<60%腫瘤細(xì)胞弱到中等染色(+)，<60%腫瘤細(xì)胞強(qiáng)染色或>60%腫瘤細(xì)胞弱到中等染色(+)，>60%腫瘤細(xì)胞強(qiáng)染色(+)5。由兩名富有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師獨(dú)立對(duì)2張組織芯片上的染色結(jié)果分別進(jìn)行評(píng)分，對(duì)同一病例的評(píng)分結(jié)果取平均值作為該病例的最終評(píng)分。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。各組資料的比較采用2 檢驗(yàn)和Fishers精確概率檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 組織芯片質(zhì)

9、量組織芯排列整齊，共有104例乳腺IDC組織和41例良性病變樣本，去除腫瘤細(xì)胞過少及掉片的樣本，并選取Galectin3與OPN二者染色共同有效者，共計(jì)135例有效樣本(乳腺IDC100例，乳腺良性病變35例)。2.2 Galectin3與OPN在乳腺良性病變及乳腺IDC中的表達(dá) Galectin3在乳腺IDC中的陽性率為87.00%(87/100)，陽性部位主要在癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在少數(shù)樣本(2.00%，2/100)中表現(xiàn)為核、質(zhì)同時(shí)表達(dá)，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色的點(diǎn)塊狀或彌散分布。Galectin3在良性病變中的陽性率為31.43%(11/35)，未發(fā)現(xiàn)核表達(dá)。Gale

10、ctin3在乳腺IDC中的中等表達(dá)率和高表達(dá)率分別為33.00%(33/100)和20.00%(20/100)，而乳腺良性病變組中無中等表達(dá)和高表達(dá)樣本，普遍呈低表達(dá)或陰性表達(dá)，兩組樣本的Galectin3表達(dá)強(qiáng)度具有顯著差異(2=47.814，P=0.000)。見表1、圖1。OPN表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色的點(diǎn)塊狀或彌散表達(dá)。OPN在乳腺良性病變和乳腺IDC中的陽性表達(dá)率均較高，分別為97.14%(34/35)和99.00%(99/100)，兩組之間表達(dá)強(qiáng)度無明顯差異(2=1.860，P=0.615)。見表2、圖2。表1 Galectin3在乳腺良性病變和IDC

11、中的表達(dá)例注：括弧內(nèi)為構(gòu)成比A. Galectin3在癌細(xì)胞的胞質(zhì)高表達(dá)，部分癌細(xì)胞出現(xiàn)核表達(dá); B. 中等表達(dá); C.低表達(dá)圖1 Galectin3在乳腺IDC中的表達(dá) Envision法×400表2 OPN在乳腺良性病變和IDC中的表達(dá)例圖2 OPN在乳腺IDC中的表達(dá) Envision法×4002.3 Galectin3、OPN表達(dá)與乳腺IDC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 2檢驗(yàn)顯示，Galectin3表達(dá)與乳腺IDC的組織學(xué)分級(jí)(2=10.464，P=0.015)、

12、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(2=19.778，P=0.000)、TNM分期(2=12.730，P=0.048)密切相關(guān);而與年齡、腫瘤最大直徑的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)2檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)作進(jìn)一步Spearman相關(guān)分析顯示：Galectin3表達(dá)強(qiáng)度與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)(分別為：rs=0.300，P=0.002;rs =0.335，P=0.001)，而與組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs=-0.004，P=0.965)。OPN的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤最大直徑(2=11.016，P=0.043)、TNM分期(2=25.159，P=0.000)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(2=17.180，P=0.000)密切

13、相關(guān)，而與年齡、組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將2檢驗(yàn)有意義的病理學(xué)參數(shù)作進(jìn)一步Spearman相關(guān)分析顯示，OPN與前述各指標(biāo)均呈正相關(guān)(分別為：rs=0.236，P=0.018;rs=0.389，P=0.000;rs =0.404，P=0.000)。見表3。表3 Galectin3與OPN在乳腺IDC中的表達(dá)例Death when it comes will have no denial.  2.4 乳腺IDC中Galectin3、OPN之間的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析顯示，乳腺IDC中Galectin3表達(dá)與OPN的表達(dá)呈正相關(guān)(rs

14、 =0.266，P=0.007)。Galectin3與OPN均為高表達(dá)的樣本共有7例，全部出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而二者均為低表達(dá)或陰性表達(dá)的樣本也有7例，均未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。 論文教育信息網(wǎng)  3 討 論Galectin3 為半乳糖苷結(jié)合蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量約為31000，具有3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，即含有12個(gè)氨基酸的NH2末端，富含甘氨酸、酪氨酸、脯氨酸的膠原樣序列以及具有糖結(jié)合位點(diǎn)的C末端6。Galectin3的表達(dá)與多種腫瘤的演進(jìn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其作用機(jī)制可能是：(1) 減少腫瘤細(xì)胞間的黏附1，同時(shí)增加癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏

15、附，促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散2。(2) 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建、腫瘤微血管發(fā)生4。(3)為Wnt/catenin的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖7。在本研究中我們也觀察到有少量乳腺癌細(xì)胞的核內(nèi)出現(xiàn)Galectin3蛋白表達(dá)，提示其確有可能參與Wnt/catenin信號(hào)途徑。(4) 激活PI3K/Akt途徑，抵抗TRAIL誘導(dǎo)的凋亡3。(5) 激活KRas途徑，賦予細(xì)胞多種致癌功能8。本研究對(duì)比乳腺IDC組和乳腺良性病變組中Galectin3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)乳腺IDC組Galectin3陽性率顯著高于乳腺良性病變組(分別為87%和31.43%);乳腺IDC中Galectin3的高表達(dá)率和

16、中等表達(dá)率分別為20.00%和33.00%，而良性病變組則普遍呈低表達(dá)或陰性表達(dá)，兩組樣本的表達(dá)強(qiáng)度具有顯著差異(2=47.814，P=0.000)。另外， Galectin3與乳腺IDC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)， 48例無轉(zhuǎn)移的乳腺IDC樣本中有11例為陰性表達(dá)，僅有2例高表達(dá)，而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的52例樣本中，僅有2例陰性表達(dá)，其余均為陽性表達(dá)，其中高表達(dá)樣本有18例，兩組之間的表達(dá)具有顯著差異(P=0.000)。同時(shí)，Galectin3表達(dá)與乳腺IDC的TNM分期呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.300，P=0.002)。在、期樣本中，Galectin3高表達(dá)率分別為4.76%(1/2

17、1)、17.30%(9/52)和37.04%(10/27)。研究數(shù)據(jù)顯示，Galectin3表達(dá)與乳腺IDC的惡性演進(jìn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系。The emperor treats talent as tools, using their strongpoint to his advantage.  人OPN基因由7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子組成。人類OPN 分子一般由信號(hào)肽序列、710 個(gè)連續(xù)ASP 序列、GRGDS(甘氨酸精氨酸甘氨酸天冬氨酸絲氨酸) 結(jié)構(gòu)域、91/41 結(jié)構(gòu)域和肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成9。OPN高表達(dá)

18、與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)，其可能機(jī)制如下：(1) 促進(jìn)蛋白溶解酶的合成、分泌，溶解細(xì)胞外基質(zhì)屏障10。(2) 與腫瘤細(xì)胞表面的CD44 結(jié)合, 對(duì)細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)以及正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的激活發(fā)揮重要作用1112。(3) 上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，誘使新血管形成1314。(4) 可能與肝細(xì)胞生長因子發(fā)揮協(xié)同作用15，促進(jìn)腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。Call no man happy until he dies.  本研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺IDC中OPN的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(2=17.180，P=0.000)

19、。在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，僅有6.25%(3/48)的乳腺IDC出現(xiàn)OPN高表達(dá)，另有12.50%(6/48)的樣本表現(xiàn)為低表達(dá)或陰性表達(dá);而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺IDC樣本中， OPN全部為中等表達(dá)或高表達(dá)，無一例低表達(dá)或陰性表達(dá)。OPN的表達(dá)強(qiáng)度與乳腺腫瘤的大小也呈正相關(guān)(rs =0.232，P=0.020)，在T1(<2 cm)組，僅有9.38%(3/32)的樣本出現(xiàn)OPN高表達(dá)，另有18.75%(6/32)的樣本表現(xiàn)為低表達(dá)或陰性表達(dá)，而在T3(>5 cm)組，則有19.05%(4/21)的樣本表現(xiàn)為OPN高表達(dá)，無一例低表達(dá)或陰性表達(dá)。另外

20、，OPN表達(dá)與TNM分期也呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.389，P=0.000)。在、期樣本中，OPN高表達(dá)率分別為 0.00%(0/21)、23.08%(12/52)和29.63%(8/27)。可見，OPN表達(dá)與乳腺IDC的侵襲和轉(zhuǎn)移也有著密切關(guān)系。You never know what you can do till you.  本研究還發(fā)現(xiàn)乳腺IDC中Galectin3與OPN的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(rs =0.266，P=0.007)。并且，二者同為高表達(dá)的樣本均出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而二者同為低表達(dá)或陰性表達(dá)的樣本則均無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Galectin3、OPN都是與腫瘤侵

21、襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，其作用機(jī)制各不相同但又存在著復(fù)雜的聯(lián)系，我們推測其可能主要通過以下方面共同促進(jìn)乳腺腫瘤演進(jìn)：(1) 通過不同方式影響細(xì)胞黏附。Galectin3可能通過影響?zhàn)ぶ叩墓δ? 從而減少腫瘤細(xì)胞間的黏附，并可能通過與大分子黏蛋白MUC12的結(jié)合促進(jìn)癌細(xì)胞與內(nèi)皮的黏附;OPN則通過與CD44的結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞與基質(zhì)的黏附1112，其表達(dá)還增加MMPs和uPA的表達(dá)，從而溶解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散10。(2) PI3KAkt途徑是這兩種基因共同的信號(hào)途徑。Galectin3是PI3KAkt途徑激活的重要信號(hào)分子3，而OPN則是該信號(hào)途徑的下游效應(yīng)

22、分子之一16，二者協(xié)同作用，共同發(fā)揮抗凋亡、促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。(3) 共同參與Wnt/Tcf信號(hào)途徑。Galectin3是Wnt信號(hào)途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其與catenin、TCF4組成三元復(fù)合物，共同啟動(dòng)下游靶基因Cyclin D1、 cmyc等的轉(zhuǎn)錄7。近年來，人們發(fā)現(xiàn)OPN可能也是該信號(hào)途徑的下游靶基因1718，Wnt信號(hào)途徑的激活也增加了OPN的表達(dá)。(4) 均與腫瘤微血管的發(fā)生密切相關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞的構(gòu)建是一個(gè)糖依賴性過程，Galectin3具有的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域作用于內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞遷移、黏附，促進(jìn)微血管的發(fā)生4;而OPN則通過上調(diào)V

23、EGF 的表達(dá),促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增生,誘使新血管形成1314。Great winds blow upon high hills.  因此，Galectin3、OPN可能是乳腺IDC侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子，其作用機(jī)制各不相同但又存在著千絲萬縷的聯(lián)系，二者協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤的演進(jìn)和轉(zhuǎn)移，在乳腺腫瘤中檢測二者的表達(dá)具有重要意義，對(duì)Galectin3、OPN作用機(jī)制的進(jìn)一步研究也可能使其成為一種新的可靠的IDC診斷標(biāo)記物和IDC患者個(gè)體化治療的靶向蛋白。【參考文獻(xiàn)】  1BAPTISTE T A,JAMES A,SARIA 

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