CyclinD1及P21cip1waf1基因在下頜骨髁狀突軟骨中的表達(dá)及其意義

1、    CyclinD1及P21cip1/waf1基 因在下頜骨髁狀突軟骨中的表達(dá)及其意義        摘要目的：探討cyclinD1及P21cip1/waf1基因表達(dá)變化對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)育中髁狀突軟骨細(xì)胞周期活動(dòng)的影響。方法：用免疫組織化學(xué)染色及原位雜交檢測(cè)mRNA技術(shù)，分別對(duì)胚胎及生后一周SD大鼠顳下頜關(guān)節(jié)不同發(fā)育時(shí)期cyclinD1蛋白及P21cip1/waf1mRNA在髁狀突軟骨中的表達(dá)進(jìn)行觀察。結(jié)果：cyclinD1在各發(fā)育時(shí)期的髁狀突軟骨增殖層及淺層肥厚

2、層中均有表達(dá)，而且從增殖層至淺層肥厚層陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯變化。P21cip1/waf1mRNA陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于髁狀突軟骨表面未分化間充質(zhì)細(xì)胞層向增殖層過(guò)渡的區(qū)域及增殖層深部向淺層肥厚層過(guò)渡的區(qū)域。結(jié)論：P21cip1/waf1在髁狀突軟骨的特征性分布提示P21cip1/waf1參與軟骨細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，P21cip1/waf1表達(dá)強(qiáng)弱的變化可能是啟動(dòng)髁狀突軟骨細(xì)胞分化的主要因素之一。關(guān)鍵詞細(xì)胞周期素D1；P21cip1/waf1基因；下頜骨髁狀突；關(guān)節(jié)軟骨；細(xì)胞周期；胚胎The expressions of cyclin D1 and P21cip1/waf1 genes in the cond

3、ylar cartilage of temporomandibular joint Li Song， Wang Huiyun,Jin Yan，et al. Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xian 710032Abstract Objective: To study the roles of the cyclin D1 and P21cip1/waf1 genes in the condylar cartilage of temporomandibular joint （TMJ）. Methods: Exp

4、ressions of cyclin D1 protein and P21cip1mRNA were observed by immunohistochemical staining and mRNA in situ hybridization in TMJ of SD rats during prenatal and postnatal development periods. Results: Cyclin D1 protein was expressed in proliferative and prehypertrophic zones of condylar cartilage in

5、 different periods of TMJ development, and no significant variety of positive cell number was observed in different parts of the condylar cartilage. The expression of P21 cip1mRNA was mainly located in the transitional areas of undifferentiated mesenchymal region to proliferative, and proliferative

6、to prehypertrophic zone. Conclusion: These data suggest that P21 cip1/waf1 is active in cell cycle regulation in chondrocytes, and that increased P21cip1/waf1 expression is associated with chondrocytes differentiation.Key wordsCyclin D1; P21 cip1/waf1; Mandibular condyle; Articular cartilage; Cell c

7、ycle ; Embryo 顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)育中髁狀突軟骨是由未分化的間充質(zhì)細(xì)胞聚集、增殖、分化而形成的。髁狀突軟骨細(xì)胞的這一周期變化活動(dòng)過(guò)程理應(yīng)受內(nèi)在基因的控制，這一點(diǎn)我們?cè)谇捌陂_展的顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)育中細(xì)胞增殖與凋亡及凋亡相關(guān)調(diào)控基因方面的研究中得以證實(shí)1，但是尚未見其它有關(guān)報(bào)道。本研究旨在通過(guò)觀察顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)育中cyclinD1和P21cip1/waf1基因的表達(dá)變化及相互關(guān)系，進(jìn)一步探討cyclinD1和P21cip1/waf1基因?qū)Πl(fā)育中髁狀突軟骨細(xì)胞周期活動(dòng)的調(diào)控作用。1材料與方法選用純系、3月齡SD大鼠(上海產(chǎn))20只，分別于妊娠13、14、15、16、17、18、19、20d脫頸處死大

8、鼠，切取胎鼠(E)顳下頜關(guān)節(jié)部置于400g/L的多聚甲醛中固定后常規(guī)脫水、石蠟包埋。另取出生后(P)1、2、3、4、5、6、7d幼鼠顳下頜關(guān)節(jié)部經(jīng)固定、脫鈣后石蠟包埋。作顳下頜關(guān)節(jié)矢狀切片，厚度5m。石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)為3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶及枸椽酸緩沖液微波修復(fù)抗原10min后，用正常羊血清封閉30min；加cyclinD1單抗（美國(guó)SantaCruz公司產(chǎn)品）置于4過(guò)夜，室溫下復(fù)溫1h后滴加生物素化二抗37反應(yīng)30min；再加ABC復(fù)合物37孵育30min，DAB顯色后，二甲苯透明、封片。131探針及標(biāo)記提取、純化P21cip1/waf1質(zhì)粒DNA。P21cip1/waf1探針

9、參照地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒（Boehringer Mannheim公司）說(shuō)明書，采用隨機(jī)引物法標(biāo)記。132P21cip1/waf1mRNA原位雜交（1）石蠟切片脫蠟至DEPC水，分別用0.2mol/LHCl和20mg/L的蛋白酶K處理，梯度酒精脫水后室溫干燥；（2）用地高辛標(biāo)記探針于42雜交后，分別用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、buffer1、buffer2依次充分洗滌；（3）用體積分?jǐn)?shù)為2%的正常羊血清封閉30min后，滴加抗地高辛堿性磷酸酶抗體孵育2h；（4）經(jīng)buffer1、buffer3漂洗后，加新配制的顯色液(NBT/BCIP顯色系統(tǒng))20l，

10、暗處顯色。中止顯色后，梯度酒精脫水，二甲苯透明封片。133P21cip1/waf1mRNA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)方法在光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)40×10高倍視野，用10×10網(wǎng)格，分別計(jì)數(shù)胎鼠髁狀突表層（superficial zone，簡(jiǎn)稱S）間充質(zhì)細(xì)胞區(qū)、深層（deep zone，簡(jiǎn)稱D）間充質(zhì)細(xì)胞區(qū)、增殖層淺部(superficial proliferation zone，簡(jiǎn)稱SP)及增殖層深部(deep proliferation zone，簡(jiǎn)稱LP)中的P21cip1/waf1mRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；出生后髁狀突表面未分化間充質(zhì)細(xì)胞區(qū)消失，故僅計(jì)數(shù)增殖層淺部及增殖層深部

11、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。計(jì)算出胚胎及出生后各組P21cip1/waf1mmRNA平均陽(yáng)性細(xì)胞百分率和標(biāo)準(zhǔn)差，并對(duì)前兩組及后兩組分別進(jìn)行2檢驗(yàn)。2結(jié)果cyclinD1陽(yáng)性細(xì)胞為胞核及核膜著棕黃色，cyclinD1在胚胎及出生后各時(shí)期髁狀突軟骨增殖層及淺層肥厚層中都有表達(dá)，而且從增殖層至淺層肥厚層陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯變化（1，2），進(jìn)入深層肥厚層后cyclinD1未見陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。cip1/waf1mRNA原位雜交P21cip1/waf1mRNA陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈紫藍(lán)色，可見蘭色顆粒。胚胎及出生后各時(shí)期髁狀突軟骨中均有P21cip1/waf1mRNA陽(yáng)性表達(dá)。胚胎時(shí)期P21cip1/waf1陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于髁狀突表

12、面未分化間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨增殖層過(guò)渡的區(qū)域及增殖層深部向淺層肥厚層過(guò)渡的區(qū)域（3，4），進(jìn)入深層肥厚層后僅在近骨化端處見個(gè)別P21cip1/waf1陽(yáng)性細(xì)胞，其余部位均未見陽(yáng)性表達(dá)。出生后P21cip1/waf1陽(yáng)性細(xì)胞主要位于增殖層向淺層肥厚層過(guò)渡的區(qū)域。各組P21cip1/waf1平均陽(yáng)性細(xì)胞率及2檢驗(yàn)結(jié)果詳見表1。1E19d髁狀突軟骨增殖層與淺層肥厚層中cyclinD1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞（40×15）2P7d髁狀突軟骨淺層肥厚層至深層肥厚層中cyclinD1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞（40×15）3E19d，髁狀突表面深層間充質(zhì)細(xì)胞區(qū)P21cip1/waf1mRNA陽(yáng)性細(xì)胞40×

13、15）4E19d，髁狀突軟骨增殖層深部與淺層肥厚層過(guò)渡區(qū)P21cip1/waf1mRNA陽(yáng)性細(xì)胞（40×15）表1胚胎及出生后各組P21cip1/waf1mRNA陽(yáng)性細(xì)胞率(%，±s)分組胚胎P21cip1出生后P21cip1SDSPDP3討論人體從胚胎的發(fā)生到組織器官的形成，都是細(xì)胞不斷增殖、分化、成熟等細(xì)胞周期活動(dòng)的結(jié)果。已有大量研究表明，細(xì)胞周期是受多層次、多因子、多基因調(diào)控的復(fù)雜的細(xì)胞生命活動(dòng)，細(xì)胞周期及其調(diào)控基因的功能異常可成為發(fā)育畸形或腫瘤發(fā)生的原因。近年來(lái)，對(duì)影響細(xì)胞周期活動(dòng)的一系列細(xì)胞周期素（cyclins）、細(xì)胞周期素依賴性激酶(cyclin depend

14、ent kinases,CDKs)及細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑(cyclin dependent kinases inhibitors,CDIs)的研究引起了極大的關(guān)注。cyclinD1基因定位于11q13，cDNA長(zhǎng)4.2kb，可編碼是相對(duì)分子質(zhì)量為36000的蛋白。有研究表明cyclinD1蛋白可與cdk4、cdk6結(jié)合，其結(jié)合物可使pRb（視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白）磷酸化，后者釋放出E2F-1轉(zhuǎn)錄因子，E2F-1作用于二氫葉酸還原酶等靶基因，使細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)2。本研究結(jié)果顯示，cyclinD1在各時(shí)期髁狀突軟骨增殖層及淺層肥厚層中均有表達(dá)，與發(fā)育中髁狀突軟骨增殖層及淺層肥厚層不斷增殖的需要相

15、符。而當(dāng)進(jìn)入深層肥厚層后，成熟軟骨細(xì)胞失去增殖能力cyclinD1表達(dá)也消失，說(shuō)明cyclinD1在軟骨細(xì)胞增殖過(guò)程發(fā)揮著積極作用。P21cip1/waf1是CDIs中KIP(kinase inhibition protein)類的成員，P21cip1/waf1基因定位于染色體6p21.2，其cDNA編碼164個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，P21cip1/waf1是目前已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白，它可通過(guò)抑制cyclinD1.cdk4、cyclinD1.cdk6、cyclinA.cdk2的蛋白激酶活性，或與DNA聚合酶的輔助因子PCNA結(jié)合，覆蓋PCNA的功能區(qū)，使DNA合成受阻，抑制

16、細(xì)胞增殖2。從本研究的cyclinD1及P21cip1/waf1的分布特點(diǎn)看，cyclinD1從增殖層至淺層肥厚層陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及表達(dá)強(qiáng)弱無(wú)明顯變化，而P21cip1/waf1的表達(dá)卻有明顯的改變。說(shuō)明在軟骨細(xì)胞的分化、成熟過(guò)程中增殖逐漸停滯并非是cyclinD1表達(dá)降低的作用，而是與P21cip1/waf1的表達(dá)增加所致。其作用機(jī)理可能是P21cip1/waf1抑制cyclinD1.cdk4、cyclinD1.cdk6等蛋白激酶活性的結(jié)果。此外，Jernvall等3報(bào)道，小鼠牙齒發(fā)育中P21cip1/waf1的表達(dá)不僅與磨牙原發(fā)性釉結(jié)節(jié)上皮增殖停滯與有關(guān)，而且還可能與上皮間充質(zhì)相互作用后細(xì)胞的分

17、化有關(guān)。Stewart等5也報(bào)道了P21cip1/waf1在嚙齒類動(dòng)物的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞中表達(dá)水平升高與軟骨細(xì)胞的肥大化有關(guān)。本研究的結(jié)果顯示，胚胎時(shí)期P21cip1/waf1陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于髁狀突表面未分化間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨增殖層過(guò)渡的區(qū)域，及增殖層向淺層肥厚層過(guò)渡的區(qū)域。胚胎時(shí)期由于髁狀突軟骨形成的需要，未分化的間充質(zhì)細(xì)胞朝著具有定向增殖為軟骨細(xì)胞功能的增殖層細(xì)胞分化，此間深層間充質(zhì)細(xì)胞區(qū)P21cip1/waf1陽(yáng)性細(xì)胞率較淺層間質(zhì)充細(xì)胞區(qū)高（P<0.01）恰與細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)型的需要相一致。特別是增殖層深部為增殖層細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵區(qū)，P21cip1/waf1在此處的高表達(dá)，則更加

18、有力地說(shuō)明P21cip1/waf1在軟骨細(xì)胞分化中所起的作用。綜上可見，在髁狀突軟骨細(xì)胞周期性活動(dòng)中，P21表達(dá)增加可抑制軟骨細(xì)胞的增殖，當(dāng)細(xì)胞增殖停滯后，P21cip1/waf1又表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用。然而，P21cip1/waf1是通過(guò)什么途徑、機(jī)理使細(xì)胞分化的，目前尚不清楚，值得今后深入研究。作者單位：西安第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院710032參考文獻(xiàn)1 李松, 金巖, 王惠蕓. Bcl-2、BAX基因與程序化細(xì)胞死亡在顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)育中的作用. 中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,（待發(fā)表）2 Ramalingam A, Hirai A, Thompson EA. Glucocorticoid inhibition of fibroblast proliferation and regulation of the cyclin kinase inhibitor P21cip1. Mol Endocrinol, 1997,11(5): 577 3 Jernvall J, AbergT, Kettunen P, et al. Th