elisa酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、e l i s a酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay簡稱ELISA）是在免疫酶技術(shù)（immunoenzymatictechniques）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)，ELISA過程包括抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被,加待測抗體 （抗原）,再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體 （抗原）,生成抗原（抗體） 待測抗體 （抗原） 酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物， 再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體（抗原）的量。待測抗體（抗原）的定量與有色酶，乙酰膽堿酯酶，6-磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的

2、酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應(yīng)，在呈色后須立刻測定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，辣根過氧化物酶（HRP）是一種糖蛋白，每個(gè)分子含有一個(gè)氯化血紅素（Protonhemin）濃度和純度計(jì)算式是（已知HRP的A（ 1cm 403nm 1%） =25,式中1%指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g,即10mg/ml,所以，酶濃度以mg/ml計(jì)算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP純度(RZ)=A403nm/A275nm純度RZ (R einheit用于免疫酶技術(shù)的酶有很多，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，3-D-半乳

3、糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的無法準(zhǔn)區(qū)作輔基。酶的濃1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110gg/ ml。在每個(gè)聚苯乙3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。 也已應(yīng)用于大分子抗原和

4、小分子抗原的定量測定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果， 靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗Zahl) 值越大說明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右，最高可達(dá)3.4。用于ELISA檢測的HRP的RZ1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，2）抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；認(rèn)為ELISA法具有原，所以也是一種早期

5、診斷的良好方法。 因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個(gè)方面：1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。2、研究抗酶抗體的合成。3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。4、定量檢測體液中抗基本方法用 于 檢 測 未 知 抗 原抗體夾心法烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。5 .終 止 反 應(yīng) ： 于 各 反 應(yīng) 孔 中 加 入2 M6.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37C孵育1小時(shí),洗滌。（同

6、時(shí)做空白、時(shí)做2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品陰性3.加酶標(biāo)抗體： 于各反應(yīng)孔中，0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 C孵育對 照 孔 及 陽 性 對加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體 （經(jīng)滴定后的稀釋度）4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液1小時(shí)。然后洗滌。（同照孔）0.1ml o 37 C孵育0.50.1ml,37 C 1030分鐘。為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以+”、-”號表示。也可測0?D值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔0?D值，若大于規(guī)定的陰性對照0D值的2.1倍，即為陽性。基本方法于 檢 測 未

7、 知 抗體的間接法用包被緩沖液將已知抗原稀釋至11 0 gg/ml，每孔加0.1ml，4 C過夜。次日洗滌3次。1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110gg/ ml。在每個(gè)聚苯乙于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，37 C孵育30-60分鐘，洗滌，最后一遍用DDW洗滌步驟抗體夾心法酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物2,2基-3-并唑啉磺-6)酸酯酶酸鹽PNP)ASMx+重氮鹽洗滌TSHR

8、+葡+甲深藍(lán)色苷酶基傘基半糖苷Mu熒光360,45ol/檬酸，的底有不止劑可催化下列反應(yīng)：HRP+H2O2復(fù)合物復(fù)合物+AH2過氧化物酶+H2O+A AH2為無色底物,供氫體；抗原抗原疫第種動抗體體抗復(fù)合物;照八、原量板,氧化物酶羊抗兔G,工作釋度004.包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4C,保存，5.稀釋液：0.01mol/LpH7.4 PBSTween20,420ml封閉液%雞8.鄰苯二胺溶液(底物)：臨用前配制0.1MNa2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸餾水稀釋至C,100保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g,檸檬酸(水加至pH2.1g/100ml), 6.1ml0ml。0.2MPBS。Na2HPO4.12H2O7.163g/100ml)6.4ml,蒸餾水12.5ml,鄰苯二 胺10mg,溶解 后,臨 用前 加30%H2 O2 40微 升。1.2.5.終止液包被抗原：用包被液將抗原作適當(dāng)稀釋洗滌：倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，加被檢血清：7.9.112mol/LH2S,一般為靜放三分鐘，110微克/孔，每孔加200微升