塞來昔布對體外宮頸癌細胞株Hela和Siha的抑制作用(1)

1、塞來昔布對體外宮頸癌細胞株Hela和Siha的抑制作用(1)【摘要】 目的：探討環(huán)氧化酶抑制劑塞來昔布對Hela和Siha細胞株細胞周期及凋亡的影響。方法：采用細胞培養(yǎng)技術(shù)及流式細胞術(shù)檢測環(huán)氧化酶抑制劑塞來昔布對人宮頸癌細胞株（Hela和Siha）細胞周期及凋亡的影響。結(jié)果：經(jīng)流式細胞術(shù)分析顯示，隨著塞來昔布濃度的增加，Hela和Siha細胞周期中G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，GM期細胞比例無明顯改變。與塞來昔布（25 mol/L）共同孵育72 h后，與空白對照組相比PI指數(shù)減?。≒0.05），凋亡率增高（P0.05）。流式分析圖中可見亞二倍體凋亡峰。結(jié)論：環(huán)氧化酶抑制劑塞來昔布可抑制體

2、外人宮頸癌細胞株Hela和Siha的增殖、促進細胞凋亡。 【關(guān)鍵詞】 宮頸癌；塞來昔布；流式細胞術(shù) Abstract Objective:To study the inhibitory effects of celecoxib,a selective cyclooxygenase-2 inhibitor,on two cervical carcinoma cell lines in vitro.Methods:The effect of cell cycle and cell apoptotic rates were analyzed by flow cytometry (FCM).Resul

3、ts:By FACS,it was found that the cell cycles of Hela and Siha cells were blocked by celecoxib,with the increasing of concentration:the G0/G1 phase ratio of Siha /Hela were increased,the S phase ratio were inhibited and the G2M phase ratio were not effected significantly.When incubated with celecoxib

4、（25mol/L）for 72 hours,the proliferation indexes(PI)were reduced（0.05）,while the apoptotic rates were increased(P0.05),we can find sub- G1 summit in FACS graph.Conclusion:Celecoxib inhibited the proliferation and induced the apoptosis of Siha and Hela cell lines in vitro. Key words Cervical cancer；Ce

5、lecoxib；Flow cytometry 宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，是癌癥造成婦女死亡的第二位原因。近年來的研究表明，環(huán)氧化酶(COX)，尤其是COX-2，與多種上皮性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，并發(fā)現(xiàn)COX抑制劑在抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用，但有關(guān)環(huán)氧化酶及其抑制劑與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展之間關(guān)系的研究較少，因此我們采用細胞培養(yǎng)技術(shù)及流式細胞術(shù)檢測選擇性COX-2抑制劑塞來昔布對人宮頸癌細胞株（Hela和Siha）增殖和凋亡的影響，為進一步探討COX抑制劑抗腫瘤作用的機制及其臨床應用積累資料。 1 材料與方法 1.1 材料 人宮頸癌細胞株Hela及Siha購自第四軍醫(yī)大學附屬西京

6、醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室。培養(yǎng)基RPMI1640購自Gibco BRL公司，小牛血清購自杭州四季青生物公司，胰酶購自sigma公司。塞來昔布購自山西威爾克科技發(fā)展公司，并溶于100二甲基亞砜中，存于4 備用。細胞培養(yǎng)與流式細胞分析均于山西醫(yī)科大學中心實驗室進行。 1.2 方法 1.2.1 細胞的培養(yǎng)： 人宮頸癌細胞株（Hela和Siha）采用RPMI 1640培養(yǎng)液，內(nèi)含10滅活小牛血清，常規(guī)培養(yǎng)于37 、5CO2、飽和濕度的孵箱中，用0.25胰酶消化傳代。 1.2.2 與藥物共同孵育后經(jīng)流式細胞儀分析： 選對數(shù)生長期的細胞按1105/mL的濃度接種于六孔培養(yǎng)板中，次日更換培養(yǎng)液后與不同濃度的塞來昔布

7、共同孵育，使其終濃度分別為12.5 mol/L，25 mol/L，50 mol/L，并設(shè)相應的空白對照組，空白對照組及各不同濃度組均做兩瓶。共同培養(yǎng)72 h后胰酶消化（0.25），收集細胞制成1106/mL的單細胞懸液，加入4 預冷的70乙醇固定細胞，PBS漂洗2次，用1 mL PBS液重新懸浮細胞，加碘化丙啶，避光染色20 min后通過流式細胞儀檢測,應用DNA細胞周期分析軟件，計算出各樣品DNA含量，分析細胞周期及凋亡率。細胞的增殖活性以增殖指數(shù)( proliferative index, PI )表示，計算公式為: PI(%)=（S+G2M）/（G0G1+S+G2M）100%。 1.2.

8、3 統(tǒng)計方法：采用SPSS for Window10.0軟件包進行統(tǒng)計分析，多個樣本均數(shù)間的比較用方差分析，P0.05為有統(tǒng)計學意義。 2 結(jié)果 塞來昔布對Hela和Siha細胞周期及細胞凋亡的影響：如表 1、表2所示，與各濃度的塞來昔布共同孵育72 h后，隨著藥物濃度的增加，Siha及Hela細胞周期發(fā)生變化：G0G1期細胞增多，S期細胞減少，G2M期細胞比例無明顯改變。同對照組相比 Siha及Hela細胞PI增殖指數(shù)減?。≒0.05），凋亡率增高（P0.05），流式分析圖中可見亞二倍體凋亡峰（見表3，圖1、圖2）。表1 塞來昔布對Siha細胞株細胞周期的影響表2 塞來昔布對Hela細胞株細

9、胞周期的影響表3 塞來昔布對Siha/Hela細胞株P(guān)I增殖指數(shù)及凋亡率的影響 * 與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05） 3 討論 環(huán)氧化酶抑制劑屬于非甾體類抗炎藥（NSAIDs），臨床上常用于消炎、鎮(zhèn)痛、解熱等治療。自100年前第一種NSAIDs藥物阿司匹林由Felix Hoffman合成，至今世界上已有50種以上不同的NSAIDs化合物投放市場。隨著對兩種環(huán)氧化酶COX-1和COX-2的認識，NSAIDs藥物根據(jù)它們對兩種環(huán)氧化酶的選擇性不同有了進一步分類，即非選擇性COX抑制劑（對COX-1和COX-2的抑制作用相似或?qū)OX-1的抑制作用更強），以及高度特異性抑制COX-2

10、的選擇性COX-2抑制劑。前者為傳統(tǒng)的NSAIDs，包括阿斯匹林、撲熱息痛、消炎痛等，后者包括新開發(fā)的 Celecoxib (塞來昔布）、Rofecoxib（羅非昔布）、NS-398等。 80年代以來，一些大型流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)長期使用COX抑制劑（NSAIDs）治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的患者，結(jié)腸癌發(fā)病率下降40%60%，同時也可明顯減少和預防食管癌、胃癌等發(fā)生的危險性。而且家族性腺瘤性息肉病患者長期服用小劑量NSALDs后，結(jié)腸息肉數(shù)目和大小均明顯降低。這使得COX抑制劑成為預防和治療腫瘤的一個新靶點。 本實驗選擇了一種選擇性COX-2抑制劑塞來昔布，采用流式細胞術(shù)，對Hela（屬于人宮頸腺癌細胞

11、株）和Siha（屬于人宮頸鱗癌細胞株）兩種細胞株進行細胞周期及細胞凋亡的分析。實驗中S%反映細胞增殖能力,增殖旺盛的細胞S%較高。PI增殖指數(shù)代表了該細胞群體中增殖期細胞的數(shù)量,在一定程度上可反映細胞的增殖狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，同塞來昔布共同孵育72 h后，Hela和Siha細胞株的細胞周期發(fā)生改變：G0G1期細胞增多，S期細胞減少，G2M期細胞比例無明顯改變，PI增殖指數(shù)減小，細胞凋亡率增加，流式圖中可見亞二倍體凋亡峰。實驗結(jié)果提示，這種藥物主要是通過將細胞阻滯在細胞周期的G0G1期，從而不同程度地抑制了體外人宮頸癌細胞株 Hela和Siha的增殖，并誘導細胞凋亡。Douglas等已分別對人結(jié)腸

12、癌、直腸癌、皮膚癌、腦膠質(zhì)細胞瘤、胰腺癌等細胞進行NS398（一種選擇性 COX-2抑制劑）體外抑制作用，結(jié)果均提示，NS398能夠抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。有研究認為，一方面COX抑制劑可通過調(diào)節(jié)bcl-2家族的表達誘導細胞凋亡；另一方面, COX抑制劑可能通過蛋白激酶C（PKC）依賴途徑調(diào)節(jié)腫瘤細胞的凋亡。 以往研究表明，NSAIDs有副作用，如對腎和消化道粘膜的損害等，這是由于COX-1被抑制所致，而其治療作用則歸功于對COX-2的抑制。傳統(tǒng)的 NSAIDs同時阻斷了 COX-1和COX-2，因此有胃腸道潰瘍和出血等副作用。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，選擇性 COX-2抑制劑與傳統(tǒng)的NSAIDs療效

13、相同，但并不抑制血小板的活性，特異性的 COX-2抑制劑塞來昔布等藥物所引起的具有臨床癥狀的潰瘍和潰瘍并發(fā)癥要少于傳統(tǒng)的 NSAIDs。目前已經(jīng)有特異性的COX-2抑制劑應用到預防、治療結(jié)腸癌的臨床中去。因此開發(fā)利用療效好，價格低，副作用少的COX-2抑制劑并將其應用到預防、治療宮頸癌的臨床中將有良好的應用前景。 【參考文獻】 Dannenberg AJ,Altorki NK,Boyle JO,et al.Cycooxygenase-2:a pharmacological target for the prevention of cancer.Lancet Onclol,2001,2:5445

14、55. Oshima M,Dinchuk JE,Kargman SL,et al.Suppression of intestinal polyposis in APC delta 716 knockout mice by inhibition of cyclooxygenase-2（COX-2）.Cell,1996,87:803809.( ) Douglas JE,Elder,Dawn E,et al.Apoptosis induction and cyclooxygenase-2 regulation in human colorectal adenoma and carcinoma cel

15、l lines by the Cyclooxygenase-2-selective Non-steroidal anti-inflammatory drug NS398.Int J Cancer,2000,86:553560. Aggarwal S,Taneja N,Lin L,et al.Indomethacin-induced apoptosis in esophageal adenocarcinoma cells involves upregulation of Bax and translocation of mitochondrial cytochrome C independent

16、 of COX-2 expression.Neoplasia,2000，2(4):346356. Zhu GH,Wong BC,Eggo MC,et al.Nonsteroidal antiinflammatory drug induced apoptosis in gastric cancer cells is blocked by protein kinase C activation through inhibition through of c-myc.Br J Cancer,1999,79:393400. Vane JR,Botting RM.Anti-inflammatory drug and their mech