基質(zhì)金屬蛋白酶-2在mRNA水平表達與乳腺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系及臨床病理相關(guān)性的研究

1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2在mRNA水平表達與乳腺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系及臨床病理相關(guān)性的研究                作者：武云飛，姜穎，肖岷，莊永志 【關(guān)鍵詞】  乳腺癌；基質(zhì)金屬蛋白酶2；轉(zhuǎn)移；RT-PCR   摘要 目的 探討乳腺癌MMP-2 mRNA表達量與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系及臨床意義。方法 采用熒光定量RT-PCR方法，分析32例乳腺原發(fā)癌和與其配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的MMP-2 mRNA表達量，分析86例臨床乳腺癌標本的MMP-2 m

2、RNA表達與臨床病理類型、臨床分期、雌孕激素受體及Her-2表達的關(guān)系。結(jié)果 32例乳腺轉(zhuǎn)移癌MMP-2 mRNA表達量低于原發(fā)癌（P0.05）；腫瘤2 cm的MMP-2 mRNA表達量高于腫瘤2 cm的表達量（P0.05）;組織分級為級、級的MMP-2 mRNA表達量低于級（P0.05）;淋巴結(jié)4個以上陽性組MMP-2 mRNA表達量低于淋巴結(jié)13個陰性組（P0.05）；MMP-2 mRNA表達量經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析與臨床分期、病理類型、雌孕激素受體及Her-2表達無關(guān)。結(jié)論 MMP-2在mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達存在負反饋調(diào)節(jié)。MMP-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達與乳腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，MMP-2在轉(zhuǎn)錄水平

3、的表達在腫瘤較小時上調(diào)，隨著腫瘤的增大其轉(zhuǎn)錄水平表達下調(diào)，隨著腫瘤惡性程度的增加，其轉(zhuǎn)錄水平的表達量在下降，在腫瘤發(fā)生的早期表達上調(diào)，隨著腫瘤的進展表達量下調(diào)。   關(guān)鍵詞 乳腺癌；基質(zhì)金屬蛋白酶2；轉(zhuǎn)移；RT-PCR   Clinical and pathologic significance and relationship between expression of matrixmetalloproteinase 2 mRNA and breast cancer metastasis    Abstract Objec

4、tive To discuss the clinical and pathology significance of matrix metalloproteinase 2,MMP-2 mRNA and the relationship between MMP-2 mRNA expression and breast cancer metastasis.Methods Detect MMP-2 mRNA expression of 32 breast cancer, metastatic lymphnode and 86 clinical breast cancer samples by flu

5、orence-quantitative RT-PCR and analyse the relativity between MMP-2 mRNA expression and clinical,pathology factors,the status of ER/PR and Her-2.Results MMP-2 mRNA expression in 32 metastatic lymph node is lower than in primary breast cancer（P0.05）.The mRNA expression of MMP-2 in tumor 2 cm is lower

6、 than in tumor2 cm（P0.05）.The MMP-2 mRNA expression in stage , is lower than in stage （P0.05）.The mRNA expression of MMP-2 in more than 4 lymphnodes positive is lower than in lymphnode 1-3 positive （P0.05）.The MMP-2 mRNA expression is irrelated with tissue grade,pathologic type,ER,PR and Her-2.Concl

7、usion MMP-2 mRNA expression is upregulated in early clinical stage,lymph node metastatic early stage,and down regulated with tumor progressing.MMP-2 mRNA expression is related with the metastasis of breast cancer.   Key words breast cancer;matrix metalloproteinase 2;metastasis;RT-PCR 

8、  腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜的過程，這一過程包括腫瘤細胞從原發(fā)灶脫離，穿越基膜及細胞外基質(zhì)浸潤遷移并進入血管，黏附于血管內(nèi)皮，進入循環(huán)系統(tǒng)并隨血流到達遠處，穿出血管侵入細胞外基質(zhì)并形成轉(zhuǎn)移灶。癌細胞脫離原發(fā)灶后，穿越組織屏障是轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。細胞外基質(zhì)（ECM）和基膜（BM）是腫瘤生長和擴散的自然屏障，基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）是腫瘤細胞產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶類，幾乎可以降解BM和ECM中的所有成分，協(xié)助腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。本研究中我院采用熒光定量RT-PCR方法檢測了86例乳腺原發(fā)癌和32例配對轉(zhuǎn)移癌中的MMP-2 mRNA定量表達，對MMP-2在mRNA水平的表達與乳腺癌轉(zhuǎn)移及臨床

9、病理因素的相關(guān)性進行探討。   1 資料與方法   1.1 一般資料 收集我院86例2003年6月2005年6月進行乳腺癌根治術(shù)的病例，術(shù)中立即取材，分別取原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌，所有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌均經(jīng)過病理組織學(xué)評價，選取癌細胞在75%以上的淋巴結(jié)?；颊吣挲g2876歲，平均48歲。原發(fā)癌86例，其中配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌32例；期7例，期55例，期24例；淋巴結(jié)陽性53例，淋巴結(jié)陰性33例；單純癌6例，浸潤性導(dǎo)管癌69例，髓樣癌7例，浸潤性小葉癌2例，腺癌2例；病理組織學(xué)分級級27例，級46例，級13例。對瘤組織進行ER、PR免疫組化檢測，陽性判定標準為陽性細胞

10、數(shù)達30%以上；采用免疫組化方法檢測Her-2受體，陽性數(shù)達10%以上為陽性。組織標本凍存于-80 冰箱中。標本收集過程中采用DEPC處理過的Epindoff管分裝，注意避免RNA酶污染。   1.2 方法   1.2.1 RNA的提取 采用Trizol試劑提取組織標本RNA，核酸分析儀測定濃度并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。   1.2.2 MMP-2引物與Tagman探針的設(shè)計與合成 引物設(shè)計采用Oligo 6.0軟件設(shè)計，管家基因采用GAPDH。每一條引物與探針序列均與Blast進行同源性比較，引物與探針由上海生工生物工程技

11、術(shù)服務(wù)有限公司合成。   MMP-2引物與探針   Forward 5-CGC TCA GAT CCG TGG TGA GAT-3   Reverse 5-CGG GAG CTC AGG CCA GAA TG-3   探針：5（FAM）-TTC TTC TTC AAG GAC CGT TCA TTT GGC-3（TAMRA）   GAPDH引物與探針   Forward 5-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3   Reverse 5-G

12、AA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3   探針：5（FAM）-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-3（TAMRA）   1.2.3 熒光定量RT-PCR實驗 采用ThermoscriptTMplus/platinumR一步法試劑盒進行熒光定量RT-PCR實驗，反應(yīng)條件按照試劑盒說明書進行，反應(yīng)體系調(diào)定為20 l。熒光定量RT-PCR結(jié)果計算：CT值代表每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所進行的循環(huán)數(shù)。以MMP-2的CT值減去GAPDH的CT值得到CT值，分組以最小CT值作為矯正數(shù)，得到CT值，計算2-CT值，以2-

13、CT值為RNA表達量。   1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 乳腺原發(fā)癌與配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌比較采用配對t檢驗，臨床病理因素組間比較采用組間t檢驗。    2 結(jié)果   2.1 32例乳腺原發(fā)癌和配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的MMP-2 mRNA表達量的對比 32例乳腺原發(fā)癌與相應(yīng)配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中MMP-2 mRNA表達量的對比分析，結(jié)果t=-3.273,P=0.021（P0.05）。結(jié)果表明32例配對轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中MMP-2 mRNA表達量低于32例乳腺原發(fā)癌中MMP-2 mRNA表達量，組間比較差異有顯著性。結(jié)果見表1。表1 32例乳腺原發(fā)癌和配對

14、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的MMP-2 mRNA表達量對比   2.2 MMP-2 mRNA表達量與臨床病理因素的關(guān)系 結(jié)果見表2。 表2 MMP-2 mRNA表達量與臨床病理因素的關(guān)系   2.3 MMP-2 mRNA表達量與ER、PR及Her-2表達的關(guān)系 結(jié)果見表3。表3 MMP-2 mRNA表達量與ER、PR及Her-2表達的關(guān)系   3 討論   腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是極其復(fù)雜的多步驟序貫過程，是眾多因子相互協(xié)調(diào)以及共同作用的結(jié)果。腫瘤的轉(zhuǎn)移過程是腫瘤細胞與宿主相互作用的極其復(fù)雜的一系列過程，現(xiàn)在人們認為腫瘤細胞從原發(fā)灶到

15、轉(zhuǎn)移灶必須經(jīng)歷以下過程1：（1）克隆性擴增，生長，異質(zhì)化，血管生成，形成轉(zhuǎn)移性亞克??；（2）黏附并進入基膜；（3）通過細胞外基質(zhì)；（4）侵入血管，與宿主淋巴細胞相互作用；（5）形成腫瘤細胞栓子；（6）腫瘤細胞與基膜黏附；（7）侵出血管；（8）轉(zhuǎn)移灶形成；（9）腫瘤血管形成；（10）轉(zhuǎn)移灶生長。由此可見腫瘤細胞從原發(fā)灶到轉(zhuǎn)移器官必須多次穿透基膜，因此研究基膜的降解對于認識腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移機制相當重要。            基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases,MM

16、Ps）是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，目前已發(fā)現(xiàn)二十余種。一般認為與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切的是MMP-2和MMP-9。MMP-2又稱型膠原酶，是參與細胞外基質(zhì)的主要成分型膠原降解的關(guān)鍵酶，在瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移的分子機制中扮演著極其重要的角色2，3，在體內(nèi)正是通過MMPs的蛋白水解作用促進腫瘤的生長和浸潤。   目前有關(guān)MMP-2與乳腺癌轉(zhuǎn)移的研究國內(nèi)文獻報道絕大多數(shù)為蛋白水平研究，有關(guān)轉(zhuǎn)錄水平研究較少。我院對32例乳腺原發(fā)癌及配對的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的MMP-2 mRNA表達量進行熒光定量RT-PCR測定，結(jié)果表明：MMP-2 mRNA在32例配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的表達量低于32例原發(fā)癌

17、的表達量，組間比較有顯著差異。眾多研究2，4，5表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌預(yù)后差的一個重要而有意義的臨床指標，MMP-2蛋白水平在轉(zhuǎn)移癌表達量高于原發(fā)癌表達量。MMP-2在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達結(jié)果的迥異說明轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)存在著內(nèi)在復(fù)雜性，也說明基因水平的表達下降可能意味著蛋白表達水平的上升6。轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)表達的內(nèi)在負反饋調(diào)節(jié)在其他相關(guān)的研究中有所報道7。這在另一方面反映了乳腺癌癌細胞轉(zhuǎn)移浸潤機制的復(fù)雜性。   病理組織學(xué)分級是乳腺癌病人傳統(tǒng)而有效的臨床預(yù)后指標。病理組織學(xué)分級越高，細胞分化越低，預(yù)后越差。我們的研究結(jié)果表明組織學(xué)分級級的MMP-2 mRNA表達水平高于組織學(xué)級、

18、組織學(xué)級的MMP-2 mRNA表達水平，而組織學(xué)級與組織學(xué)級間MMP-2 mRNA表達量差異不顯著，說明組織學(xué)分級越高，癌細胞分化越差，MMP-2 mRNA表達水平下調(diào)，證實MMP-2表達在mRNA水平在轉(zhuǎn)錄過程中存在著負反饋調(diào)節(jié)機制，隨癌組織惡性程度升高，其MMP-2在mRNA水平表達下調(diào)。臨床分期是評估乳腺癌根治術(shù)后預(yù)后及生存的重要臨床依據(jù)。臨床分期越高說明乳腺癌病期越晚預(yù)后越差，本研究結(jié)果表明MMP-2 mRNA表達量與臨床分期無相關(guān)性，單純從臨床分期分析對MMP-2在mRNA水平的表達無明顯相關(guān)性，說明MMP-2 mRNA在表達存在負反饋調(diào)節(jié)機制。說明MMP-2是在腫瘤發(fā)生的早期出現(xiàn)m

19、RNA轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)，當腫瘤增大到一定程度時，其表達量出現(xiàn)下調(diào)。   Hirvonen等8研究發(fā)現(xiàn)MMP-2在乳腺癌中表達與大多數(shù)傳統(tǒng)的組織病理學(xué)和臨床預(yù)后因子無關(guān)。在本研究中分析了淋巴結(jié)陽性和淋巴結(jié)陰性的乳腺原發(fā)癌的MMP-2 mRNA的表達量，結(jié)果表明淋巴結(jié)陽性的乳腺癌組MMP-2 mRNA的表達量略高于淋巴結(jié)陰性的乳腺癌組MMP-2 mRNA的相對表達量，但組間比較差異不顯著。86例乳腺癌依據(jù)術(shù)后病理結(jié)果分成4組：即單純癌、髓樣癌、浸潤性導(dǎo)管癌、浸潤性小葉腺癌。本組資料的統(tǒng)計結(jié)果顯示MMP-2在mRNA水平表達量與病理類型不相關(guān)。各病理類型間  

20、MMP-2 mRNA表達水平無差異，說明病理形態(tài)學(xué)分類與腫瘤的MMP-2在mRNA水平轉(zhuǎn)錄表達無關(guān)。同時我院對86例乳腺癌臨床資料中MMP-2 mRNA表達量與ER、PR狀態(tài)及Her-2陽性與Her-2陰性的病例進行了分組對比，結(jié)果表明MMP-2 mRNA表達量與ER-PR狀態(tài)無關(guān)，Her-2陽性組的MMP-2 mRNA表達量高于Her-2陰性組，但兩組之間差異不顯著。綜上所述，本研究結(jié)果證實了Hirvonen等的研究結(jié)論。   乳腺癌患者治療失敗，其主要原因是由于癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移未得到控制，而乳腺癌癌細胞的轉(zhuǎn)移與微環(huán)境密切相關(guān)。MMP-2正是這種微環(huán)境中重要一分子。本研

21、究證實MMP-2在mRNA水平的表達與乳腺癌的轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，MMP-2在轉(zhuǎn)錄水平的表達存在負反饋調(diào)節(jié)，MMP-2在乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。   參考文獻   1 李甘地.病理學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，2003，118-121.   2 Zucker S,Hymowilz M,Rello EE,et al.Tumorgenic potential of extracellular matrix metalloproteinases inducer.Am J Pathol,2001,158（6）:1921-1928.   3 Paul MT,Richard JW,Matthew NH,et al.Breast cancer cell-derived EMMPRIN stimulates fibroblast MMP-2 release through a phospholipase A2 and 5-lipoxygenase catalyzed pathway.Oncogene,2002,21（37）:5765-5770.   4 范松青.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在乳腺癌中的表達及其臨床意義，癌癥，2003，22（9）：968-973.