基質金屬蛋白酶-2在mRNA水平表達與乳腺癌轉移關系及臨床病理相關性的研究

1、基質金屬蛋白酶-2在mRNA水平表達與乳腺癌轉移關系及臨床病理相關性的研究                作者：武云飛，姜穎，肖岷，莊永志 【關鍵詞】  乳腺癌；基質金屬蛋白酶2；轉移；RT-PCR   摘要 目的 探討乳腺癌MMP-2 mRNA表達量與乳腺癌轉移的關系及臨床意義。方法 采用熒光定量RT-PCR方法，分析32例乳腺原發(fā)癌和與其配對淋巴結轉移癌的MMP-2 mRNA表達量，分析86例臨床乳腺癌標本的MMP-2 m

2、RNA表達與臨床病理類型、臨床分期、雌孕激素受體及Her-2表達的關系。結果 32例乳腺轉移癌MMP-2 mRNA表達量低于原發(fā)癌（P0.05）；腫瘤2 cm的MMP-2 mRNA表達量高于腫瘤2 cm的表達量（P0.05）;組織分級為級、級的MMP-2 mRNA表達量低于級（P0.05）;淋巴結4個以上陽性組MMP-2 mRNA表達量低于淋巴結13個陰性組（P0.05）；MMP-2 mRNA表達量經過統(tǒng)計學分析與臨床分期、病理類型、雌孕激素受體及Her-2表達無關。結論 MMP-2在mRNA轉錄水平的表達存在負反饋調節(jié)。MMP-2 mRNA轉錄水平的表達與乳腺癌轉移有關，MMP-2在轉錄水平

3、的表達在腫瘤較小時上調，隨著腫瘤的增大其轉錄水平表達下調，隨著腫瘤惡性程度的增加，其轉錄水平的表達量在下降，在腫瘤發(fā)生的早期表達上調，隨著腫瘤的進展表達量下調。   關鍵詞 乳腺癌；基質金屬蛋白酶2；轉移；RT-PCR   Clinical and pathologic significance and relationship between expression of matrixmetalloproteinase 2 mRNA and breast cancer metastasis    Abstract Objec

4、tive To discuss the clinical and pathology significance of matrix metalloproteinase 2,MMP-2 mRNA and the relationship between MMP-2 mRNA expression and breast cancer metastasis.Methods Detect MMP-2 mRNA expression of 32 breast cancer, metastatic lymphnode and 86 clinical breast cancer samples by flu

5、orence-quantitative RT-PCR and analyse the relativity between MMP-2 mRNA expression and clinical,pathology factors,the status of ER/PR and Her-2.Results MMP-2 mRNA expression in 32 metastatic lymph node is lower than in primary breast cancer（P0.05）.The mRNA expression of MMP-2 in tumor 2 cm is lower

6、 than in tumor2 cm（P0.05）.The MMP-2 mRNA expression in stage , is lower than in stage （P0.05）.The mRNA expression of MMP-2 in more than 4 lymphnodes positive is lower than in lymphnode 1-3 positive （P0.05）.The MMP-2 mRNA expression is irrelated with tissue grade,pathologic type,ER,PR and Her-2.Concl

7、usion MMP-2 mRNA expression is upregulated in early clinical stage,lymph node metastatic early stage,and down regulated with tumor progressing.MMP-2 mRNA expression is related with the metastasis of breast cancer.   Key words breast cancer;matrix metalloproteinase 2;metastasis;RT-PCR 

8、  腫瘤的轉移是一個極其復雜的過程，這一過程包括腫瘤細胞從原發(fā)灶脫離，穿越基膜及細胞外基質浸潤遷移并進入血管，黏附于血管內皮，進入循環(huán)系統(tǒng)并隨血流到達遠處，穿出血管侵入細胞外基質并形成轉移灶。癌細胞脫離原發(fā)灶后，穿越組織屏障是轉移的關鍵步驟。細胞外基質（ECM）和基膜（BM）是腫瘤生長和擴散的自然屏障，基質金屬蛋白酶9（MMP-9）是腫瘤細胞產生或誘導產生的蛋白酶類，幾乎可以降解BM和ECM中的所有成分，協(xié)助腫瘤細胞轉移。本研究中我院采用熒光定量RT-PCR方法檢測了86例乳腺原發(fā)癌和32例配對轉移癌中的MMP-2 mRNA定量表達，對MMP-2在mRNA水平的表達與乳腺癌轉移及臨床

9、病理因素的相關性進行探討。   1 資料與方法   1.1 一般資料 收集我院86例2003年6月2005年6月進行乳腺癌根治術的病例，術中立即取材，分別取原發(fā)癌和淋巴結轉移癌，所有淋巴結轉移癌均經過病理組織學評價，選取癌細胞在75%以上的淋巴結?；颊吣挲g2876歲，平均48歲。原發(fā)癌86例，其中配對淋巴結轉移癌32例；期7例，期55例，期24例；淋巴結陽性53例，淋巴結陰性33例；單純癌6例，浸潤性導管癌69例，髓樣癌7例，浸潤性小葉癌2例，腺癌2例；病理組織學分級級27例，級46例，級13例。對瘤組織進行ER、PR免疫組化檢測，陽性判定標準為陽性細胞

10、數(shù)達30%以上；采用免疫組化方法檢測Her-2受體，陽性數(shù)達10%以上為陽性。組織標本凍存于-80 冰箱中。標本收集過程中采用DEPC處理過的Epindoff管分裝，注意避免RNA酶污染。   1.2 方法   1.2.1 RNA的提取 采用Trizol試劑提取組織標本RNA，核酸分析儀測定濃度并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。   1.2.2 MMP-2引物與Tagman探針的設計與合成 引物設計采用Oligo 6.0軟件設計，管家基因采用GAPDH。每一條引物與探針序列均與Blast進行同源性比較，引物與探針由上海生工生物工程技

11、術服務有限公司合成。   MMP-2引物與探針   Forward 5-CGC TCA GAT CCG TGG TGA GAT-3   Reverse 5-CGG GAG CTC AGG CCA GAA TG-3   探針：5（FAM）-TTC TTC TTC AAG GAC CGT TCA TTT GGC-3（TAMRA）   GAPDH引物與探針   Forward 5-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3   Reverse 5-G

12、AA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3   探針：5（FAM）-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-3（TAMRA）   1.2.3 熒光定量RT-PCR實驗 采用ThermoscriptTMplus/platinumR一步法試劑盒進行熒光定量RT-PCR實驗，反應條件按照試劑盒說明書進行，反應體系調定為20 l。熒光定量RT-PCR結果計算：CT值代表每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所進行的循環(huán)數(shù)。以MMP-2的CT值減去GAPDH的CT值得到CT值，分組以最小CT值作為矯正數(shù)，得到CT值，計算2-CT值，以2-

13、CT值為RNA表達量。   1.3 統(tǒng)計學方法 乳腺原發(fā)癌與配對淋巴結轉移癌比較采用配對t檢驗，臨床病理因素組間比較采用組間t檢驗。    2 結果   2.1 32例乳腺原發(fā)癌和配對淋巴結轉移癌的MMP-2 mRNA表達量的對比 32例乳腺原發(fā)癌與相應配對淋巴結轉移癌中MMP-2 mRNA表達量的對比分析，結果t=-3.273,P=0.021（P0.05）。結果表明32例配對轉移淋巴結中MMP-2 mRNA表達量低于32例乳腺原發(fā)癌中MMP-2 mRNA表達量，組間比較差異有顯著性。結果見表1。表1 32例乳腺原發(fā)癌和配對

14、淋巴結轉移癌的MMP-2 mRNA表達量對比   2.2 MMP-2 mRNA表達量與臨床病理因素的關系 結果見表2。 表2 MMP-2 mRNA表達量與臨床病理因素的關系   2.3 MMP-2 mRNA表達量與ER、PR及Her-2表達的關系 結果見表3。表3 MMP-2 mRNA表達量與ER、PR及Her-2表達的關系   3 討論   腫瘤的浸潤和轉移是極其復雜的多步驟序貫過程，是眾多因子相互協(xié)調以及共同作用的結果。腫瘤的轉移過程是腫瘤細胞與宿主相互作用的極其復雜的一系列過程，現(xiàn)在人們認為腫瘤細胞從原發(fā)灶到

15、轉移灶必須經歷以下過程1：（1）克隆性擴增，生長，異質化，血管生成，形成轉移性亞克??；（2）黏附并進入基膜；（3）通過細胞外基質；（4）侵入血管，與宿主淋巴細胞相互作用；（5）形成腫瘤細胞栓子；（6）腫瘤細胞與基膜黏附；（7）侵出血管；（8）轉移灶形成；（9）腫瘤血管形成；（10）轉移灶生長。由此可見腫瘤細胞從原發(fā)灶到轉移器官必須多次穿透基膜，因此研究基膜的降解對于認識腫瘤浸潤、轉移機制相當重要。            基質金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases,MM

16、Ps）是一組鋅離子依賴性內肽酶，目前已發(fā)現(xiàn)二十余種。一般認為與腫瘤浸潤和轉移關系最密切的是MMP-2和MMP-9。MMP-2又稱型膠原酶，是參與細胞外基質的主要成分型膠原降解的關鍵酶，在瘤細胞的浸潤和轉移的分子機制中扮演著極其重要的角色2，3，在體內正是通過MMPs的蛋白水解作用促進腫瘤的生長和浸潤。   目前有關MMP-2與乳腺癌轉移的研究國內文獻報道絕大多數(shù)為蛋白水平研究，有關轉錄水平研究較少。我院對32例乳腺原發(fā)癌及配對的淋巴結轉移癌的MMP-2 mRNA表達量進行熒光定量RT-PCR測定，結果表明：MMP-2 mRNA在32例配對淋巴結轉移癌的表達量低于32例原發(fā)癌

17、的表達量，組間比較有顯著差異。眾多研究2，4，5表明淋巴結轉移是乳腺癌預后差的一個重要而有意義的臨床指標，MMP-2蛋白水平在轉移癌表達量高于原發(fā)癌表達量。MMP-2在轉錄和蛋白水平表達結果的迥異說明轉錄與轉錄調節(jié)存在著內在復雜性，也說明基因水平的表達下降可能意味著蛋白表達水平的上升6。轉錄與轉錄調節(jié)表達的內在負反饋調節(jié)在其他相關的研究中有所報道7。這在另一方面反映了乳腺癌癌細胞轉移浸潤機制的復雜性。   病理組織學分級是乳腺癌病人傳統(tǒng)而有效的臨床預后指標。病理組織學分級越高，細胞分化越低，預后越差。我們的研究結果表明組織學分級級的MMP-2 mRNA表達水平高于組織學級、

18、組織學級的MMP-2 mRNA表達水平，而組織學級與組織學級間MMP-2 mRNA表達量差異不顯著，說明組織學分級越高，癌細胞分化越差，MMP-2 mRNA表達水平下調，證實MMP-2表達在mRNA水平在轉錄過程中存在著負反饋調節(jié)機制，隨癌組織惡性程度升高，其MMP-2在mRNA水平表達下調。臨床分期是評估乳腺癌根治術后預后及生存的重要臨床依據(jù)。臨床分期越高說明乳腺癌病期越晚預后越差，本研究結果表明MMP-2 mRNA表達量與臨床分期無相關性，單純從臨床分期分析對MMP-2在mRNA水平的表達無明顯相關性，說明MMP-2 mRNA在表達存在負反饋調節(jié)機制。說明MMP-2是在腫瘤發(fā)生的早期出現(xiàn)m

19、RNA轉錄水平的上調，當腫瘤增大到一定程度時，其表達量出現(xiàn)下調。   Hirvonen等8研究發(fā)現(xiàn)MMP-2在乳腺癌中表達與大多數(shù)傳統(tǒng)的組織病理學和臨床預后因子無關。在本研究中分析了淋巴結陽性和淋巴結陰性的乳腺原發(fā)癌的MMP-2 mRNA的表達量，結果表明淋巴結陽性的乳腺癌組MMP-2 mRNA的表達量略高于淋巴結陰性的乳腺癌組MMP-2 mRNA的相對表達量，但組間比較差異不顯著。86例乳腺癌依據(jù)術后病理結果分成4組：即單純癌、髓樣癌、浸潤性導管癌、浸潤性小葉腺癌。本組資料的統(tǒng)計結果顯示MMP-2在mRNA水平表達量與病理類型不相關。各病理類型間  

20、MMP-2 mRNA表達水平無差異，說明病理形態(tài)學分類與腫瘤的MMP-2在mRNA水平轉錄表達無關。同時我院對86例乳腺癌臨床資料中MMP-2 mRNA表達量與ER、PR狀態(tài)及Her-2陽性與Her-2陰性的病例進行了分組對比，結果表明MMP-2 mRNA表達量與ER-PR狀態(tài)無關，Her-2陽性組的MMP-2 mRNA表達量高于Her-2陰性組，但兩組之間差異不顯著。綜上所述，本研究結果證實了Hirvonen等的研究結論。   乳腺癌患者治療失敗，其主要原因是由于癌細胞的侵襲、轉移未得到控制，而乳腺癌癌細胞的轉移與微環(huán)境密切相關。MMP-2正是這種微環(huán)境中重要一分子。本研

21、究證實MMP-2在mRNA水平的表達與乳腺癌的轉移存在相關性，MMP-2在轉錄水平的表達存在負反饋調節(jié)，MMP-2在乳腺癌的浸潤和轉移過程中發(fā)揮了重要作用。   參考文獻   1 李甘地.病理學.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003，118-121.   2 Zucker S,Hymowilz M,Rello EE,et al.Tumorgenic potential of extracellular matrix metalloproteinases inducer.Am J Pathol,2001,158（6）:1921-1928.   3 Paul MT,Richard JW,Matthew NH,et al.Breast cancer cell-derived EMMPRIN stimulates fibroblast MMP-2 release through a phospholipase A2 and 5-lipoxygenase catalyzed pathway.Oncogene,2002,21（37）:5765-5770.   4 范松青.基質金屬蛋白酶及其抑制劑在乳腺癌中的表達及其臨床意義，癌癥，2003，22（9）：968-973.