土壤中枯草芽孢桿菌的分離和篩選(共4頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上土壤中枯草芽孢桿菌的分離和篩選劉倩倩一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.掌握枯草芽孢桿菌的分離篩選的基本原理，熟練掌握無(wú)菌接種技術(shù)、微生物分離篩選技術(shù)和微生物形態(tài)觀察技術(shù)。2.了解枯草芽孢桿菌的分布、營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)等特點(diǎn)，以及它所具有的產(chǎn)淀粉酶的功能。根據(jù)這些特點(diǎn)進(jìn)行分離和篩選，從而得到純菌株。 二、 實(shí)驗(yàn)原理 枯草芽孢桿菌屬革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢0.60.9×1.01.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。需氧菌。有的菌株是-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌；有的菌株具有強(qiáng)烈降解核苷酸的酶系

2、。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中。選擇含淀粉豐富的土壤為最佳，80度的水浴處理樣品1小時(shí)，目的是殺死微生物營(yíng)養(yǎng)體，殘留芽胞。利用稀釋涂布法，在淀粉的培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)1-3天后，觀察。然后，進(jìn)行初篩與純化，利用顯微鏡進(jìn)行革蘭氏染色，確認(rèn)是否為枯草芽孢桿菌。再?gòu)?fù)篩，測(cè)定其淀粉酶活，最后確定菌株。三、實(shí)驗(yàn)材料 （1）選擇培養(yǎng)基 本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌的篩選，所以應(yīng)選淀粉培養(yǎng)基。 配方： 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化鈉 5.0g 可溶性淀粉 10.0g 瓊脂 20g 蒸餾水 1000ml 調(diào)整pH至7.2 配置時(shí)應(yīng)先把淀粉用少量蒸餾水調(diào)成糊狀，再加入到融化好的培養(yǎng)基中。 （2

3、）溶液或試劑 牛肉膏 1.25g 蛋白胨 2.5g 氯化鈉 1.25g 可溶性淀粉 2.5g 瓊脂 5g 碘11克，碘原液2毫升，碘化鉀42克，可溶性淀粉2克，磷酸氫二鈉45.23克，檸檬酸8.068克，氯化鈷25克，重鉻酸鉀3.34克， 100毫升0.01NHCL。 （3）儀器或其他用品 平板培養(yǎng)皿 10個(gè)、試管15支、三角瓶2個(gè)、燒杯3個(gè)、稱量紙、高壓蒸汽滅菌鍋、干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、無(wú)菌涂布器、電熱恒溫水浴、500ml量筒、顯微鏡、無(wú)菌吸管、無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌刻度吸管、酒精燈、記號(hào)筆、火柴、試管架、接種鉤、滴管等。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 倒平板制備梯度稀釋液涂布培養(yǎng)初篩復(fù)篩純化保存（1）

4、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 制備淀粉培養(yǎng)基，無(wú)菌水，在121攝氏度下滅菌20min。倒平板。把接種工具，培養(yǎng)基，和其他用品全部在超凈工作臺(tái)上擺好，進(jìn)行紫外線滅菌30min。（2）制備土壤稀釋液 取土樣時(shí)最好選取如花壇等地方的土樣，選好采樣地點(diǎn)，產(chǎn)去表層5cm，去5-15cm處。用無(wú)菌器具規(guī)范采樣幾十克，裝入無(wú)菌的塑料袋或紙袋中扎好，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、采樣環(huán)境等以備考證。采樣后應(yīng)盡快分離。振搖約二十分鐘，使土樣與水充分混合，將細(xì)胞分散。放入盛有99ml無(wú)菌水三角瓶中，常壓80度的水浴處理樣品1小時(shí)后，取出。 用一支1ml無(wú)菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無(wú)菌水的大試管中充分混勻，然后用無(wú)菌吸管從此試

5、管中吸取1ml加入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此類推，制成10-2 、10-3、10-4、10-5不同稀釋度的土壤溶液。 （3）涂布 將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號(hào)筆寫上10-3、10-4、10-5三種稀釋度，然后用無(wú)菌吸管分別由10-3、10-4、10-5三管土壤稀釋液中各吸取0.2ml，小心地滴在對(duì)應(yīng)平板培養(yǎng)基表面中央位置。 用無(wú)菌涂布器涂布。右手拿無(wú)菌涂布器平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。室溫下靜置5-10min，使菌液浸入培養(yǎng)基。 （4）培養(yǎng) 將淀粉培養(yǎng)基平板倒置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)13d。 （5）初篩 觀

6、察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黃色，將這樣的菌種單個(gè)菌落分別挑取少許細(xì)胞接種到培養(yǎng)基上，置于30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需要再一次進(jìn)行分離純化。（如不能用肉眼更好的觀察，可對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，與標(biāo)準(zhǔn)菌種比較。） （6）復(fù)篩 測(cè)定其淀粉酶活。 1）試劑和器材 1.試劑 ： 碘原液：稱取碘11克，碘化鉀22克，加水溶解，稀釋至500毫升。 稀碘液：取碘原液2毫升，加碘化鉀20克，稀釋至500毫升，此試劑隨配隨用。 2%淀粉液：稱取干燥過(guò)的可溶性淀粉2克，加5毫升蒸餾水，攪拌混和，再徐徐傾入70毫升煮沸的蒸餾水中。繼續(xù)煮沸2分鐘，冷卻至室溫，加入磷酸氫二鈉-檸

7、檬酸緩沖液（PH為6）。 檸檬酸緩沖液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）45.23克，檸檬酸（C6H8O7?H2O）8.068克，加水溶解，稀釋至1000毫升。 標(biāo)準(zhǔn)比色液：稱取氯化鈷（CoCL2?6H2O）25克和重鉻酸鉀3.34克溶于100毫升0.01N HCL，其五倍稀釋作標(biāo)準(zhǔn)。 樣品：細(xì)菌-淀粉酶2.器材 電熱恒溫水浴 試管 量筒 吸量管（1ml） 3.操作方法： 1)取試管1支，加20毫升2%淀粉，混勻，在30水浴中，使管內(nèi)溫度達(dá)到30。 2)將淀粉酶0.5ml加到30的淀粉液中，混勻，在30水浴中保溫，自加入記時(shí)，經(jīng)5 分鐘后取反應(yīng)液1毫升，加入盛有5毫升稀碘液的試管中?；靹颍繙y(cè)比色，每隔一定時(shí)間重復(fù)測(cè)定，直至呈色與標(biāo)準(zhǔn)比色顏色相同為止，記錄反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間。 3)計(jì)算。在上述條件下，每一小時(shí)催化1毫升2%可溶性淀粉水解的酶量，定為一個(gè)酶活力單位。 (7)純化并保存 菌種保存時(shí)一般都需要不受雜菌污染，菌種變異很少，并能盡量保持細(xì)菌的形態(tài)和生理性狀不發(fā)生變化。同時(shí)，做好以下工作： 做好菌種保存記錄，