應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究HL60細(xì)胞及其耐阿霉素細(xì)胞株的蛋白

1、    應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究HL60細(xì)胞及其耐阿霉素細(xì)胞株的蛋白表達(dá)差異作者：胡建達(dá)， 林敏輝， 陳鑫基， 劉庭波， 魏天南， 李 靜， 呂聯(lián)煌 作者單位：福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院、福建省血液病研究所，福州 350001【摘要】 目的 比較人髓系白血病細(xì)胞株HL60細(xì)胞和耐阿霉素的細(xì)胞(HL60/ADR)的整體蛋白表達(dá)譜，以期獲得人髓系白血病細(xì)胞的耐藥相關(guān)蛋白。 方法 提取HL60細(xì)胞和HL60/ADR細(xì)胞的總蛋白，采用熒光差異顯示的雙向凝膠電泳技術(shù)(DIGE)比較分析差異表達(dá)蛋白;經(jīng)膠內(nèi)酶解，MALDITOF/TOF質(zhì)譜分析，搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，獲得

2、差異蛋白質(zhì)的信息。 結(jié)果 經(jīng)過初步篩選和質(zhì)譜分析共獲得16個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的表達(dá)差異蛋白點(diǎn)，其中13個(gè)在HL60細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，3個(gè)表達(dá)下調(diào)。主要是代謝酶類、DNA修復(fù)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白和細(xì)胞增殖與凋亡等相關(guān)的蛋白。 結(jié)論 根據(jù)人髓系白血病細(xì)胞株HL60細(xì)胞和HL60/ADR細(xì)胞的差異蛋白表達(dá)譜比較，篩選出耐藥相關(guān)蛋白。【關(guān)鍵詞】 HL60白血病細(xì)胞; 白血病; 電泳，凝膠，雙向; 蛋白質(zhì)組學(xué); 多藥耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)類白血病是一組異質(zhì)性造血系統(tǒng)惡性腫瘤，目前的治療方法仍以化療為主，近年來白血病的治療已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但是對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥依然是大多數(shù)白血病治療失敗的主要原因

3、。多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是耐藥的主要機(jī)制之一，但可能仍存在其它耐藥相關(guān)機(jī)制尚未被了解12。為了更好地了解在耐藥發(fā)生過程中蛋白質(zhì)所發(fā)揮的作用，筆者應(yīng)用人髓系白血病細(xì)胞株HL60細(xì)胞和耐阿霉素的HL60細(xì)胞(HL60/ADR)作為模型，采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)熒光差異顯示的雙向凝膠電泳(two dimensional difference in gel electrophoresis,2D DIGE)比較兩者間表達(dá)蛋白的差異，旨在從蛋白質(zhì)整體水平對(duì)細(xì)胞耐藥現(xiàn)象發(fā)生后產(chǎn)生的相關(guān)蛋白變化進(jìn)行研究，探討耐藥產(chǎn)生的機(jī)制，為進(jìn)一步尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。1 材料和方

4、法1.1 材料1.1.1 主要試劑和儀器 考馬斯亮蘭R350(瑞典AMERSHAM)，十二烷基磺酸鈉(SDS)、甘氨酸、丙烯酰胺、TEMED(美國BioRad)。Ettan IPGphor 等電聚焦系統(tǒng)(瑞典AMERSHAM)，Hofer SE 600(瑞典AMERSHAM)，掃描儀(GS 710，美國BioRad)。1.1.2 細(xì)胞株 人髓系白血病細(xì)胞株HL60細(xì)胞和HL60/ADR細(xì)胞引自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 2株細(xì)胞分別在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2.2 樣

5、品的制備和定量 收集生長良好、對(duì)數(shù)生長期的HL60細(xì)胞和HL60/ADR細(xì)胞各1×107，離心(1 000 r/min，5 min )，棄上清，加入適量的PBS洗滌，再離心(1 000 r/min，5 min )，重復(fù)3次，獲得洗滌后的細(xì)胞。每管加入200 L DIGE 裂解緩沖液7 mol/L Urea，2 mol/L 硫脲，4% CHAPS，0.2%固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)緩沖液，羅氏混合酶抑制劑，冰浴超聲破碎(80 W，每次6 s，間隔10 s，共8次，置于冰上)，然后離心(14 000 r/min，1 h)，收集上清液。使用Bi

6、oRad 蛋白檢測(cè)試劑測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將2組蛋白樣品分裝于0.5 mL離心管中，-80 低溫保存。1.2.3 DIGE實(shí)驗(yàn) 把蛋白樣品濃度稀釋到5 g/L，將所有樣品等量混合，然后按50 g/10 L分裝即成為各自的內(nèi)標(biāo)。取樣本和內(nèi)標(biāo)各50 g，分別用Cy2、Cy3、Cy5熒光染料進(jìn)行標(biāo)記(按每50 g樣品標(biāo)記400 pmol染料)。將上述3個(gè)標(biāo)記好的樣品混合，進(jìn)行等電聚焦電泳(IEF)，pH為310，13 cm非線性膠條。電泳條件：30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h，500 V 4 h。等電聚焦完畢后，將IPG膠條置于平衡液中平衡后，進(jìn)行第

7、二相電泳。十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDSPAGE)膠濃度為12.5%，每塊凝膠先用15 mA 電泳20 min，再用30 mA電泳至溴酚藍(lán)離膠下沿0.5 cm左右即可結(jié)束電泳，注意始終要避光。1.2.4 凝膠圖像掃描及軟件分析 使用Typhoon掃描儀，分別采用3種不同的波長488 nm (Cy2)、532 nm (Cy3)、633 nm (Cy5)進(jìn)行掃描，獲得圖譜。用DeCyder 5.0 分析軟件(GE 公司)分析結(jié)果，得到平均比值>1.2的差異點(diǎn)。1.2.5 蛋白差異點(diǎn)的酶解和鑒定 電泳完畢，將凝膠用考馬斯亮蘭染色后，切下蛋白差異點(diǎn)用胰酶進(jìn)行膠內(nèi)酶解20 h，抽提酶解肽段，

8、經(jīng)Zip Tip脫鹽后，進(jìn)行MALDITOF/TOF質(zhì)譜，軟件分析數(shù)據(jù)，鑒定蛋白質(zhì)。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異用Students t 檢驗(yàn)。2 結(jié) 果2.1 DIGE凝膠圖譜 通過雙向凝膠電泳，在HL60細(xì)胞和HL60/ADR細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白DIGE凝膠圖譜中可見所表達(dá)的蛋白點(diǎn)數(shù)多，分布均勻且清晰，經(jīng)過DIGE標(biāo)記，篩選出在HL60細(xì)胞和HL60/ADR細(xì)胞之間表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)，可以用于下一步的質(zhì)譜分析(圖1)。2.2 MALDITOF/TOF質(zhì)譜鑒定 切下HL60 綠色框內(nèi)為差異蛋白點(diǎn)的位置;黃色框內(nèi)為差異蛋白點(diǎn)的編號(hào).細(xì)胞和HL60/ADR細(xì)胞的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行酶解，采用質(zhì)譜分

9、析技術(shù)MALDITOF/TOF鑒定，差異蛋白點(diǎn)的性質(zhì)見表1。表1 經(jīng)MALDITOF/TOF質(zhì)譜鑒定的差異表達(dá)蛋白2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的歸類 經(jīng)過初步篩選和質(zhì)譜分析共得到18個(gè)表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)，其中有2個(gè)差異蛋白點(diǎn)經(jīng)鑒定屬于同一種蛋白質(zhì)(蛋白點(diǎn)940和955同為mutant betaactin，蛋白點(diǎn)1 536和1 538同為nucleolar phosphoprotein B23)，因此，通過比較HL60細(xì)胞和HL60/ADR細(xì)胞的差異蛋白表達(dá)，最終得到16個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的表達(dá)差異蛋白點(diǎn)(均P<0.001)，其中13個(gè)在HL60/ADR細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)(以“+”號(hào)表示)，3個(gè)表達(dá)下調(diào)

10、(以“-”號(hào)表示)。它們主要是代謝酶類以及與DNA修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)的蛋白質(zhì)。3 討 論MDR是指腫瘤細(xì)胞在接觸一種抗腫瘤藥產(chǎn)生耐藥性后，對(duì)未接觸過的、結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制各異的其他抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性，導(dǎo)致聯(lián)合化療失敗。因此，MDR已成為白血病化療失敗、疾病復(fù)發(fā)的一個(gè)主要根源。近年來，探索MDR產(chǎn)生的機(jī)制及針對(duì)各種MDR機(jī)制所進(jìn)行的耐藥逆轉(zhuǎn)策略，已經(jīng)成為近年國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。白血病等腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生實(shí)際上是腫瘤細(xì)胞對(duì)抗細(xì)胞毒藥物的損傷作用，維持自身穩(wěn)定的一種防御機(jī)制;從分子水平看，腫瘤細(xì)胞耐藥性的形成是由于與耐藥性有關(guān)的一系列基因被誘導(dǎo)表達(dá)所致1

11、2。蛋白質(zhì)組學(xué)是以整體蛋白質(zhì)作為研究對(duì)象，為尋找耐藥相關(guān)蛋白提供了一個(gè)全新的手段34。筆者所應(yīng)用的DIGE技術(shù)是在2DE技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的定量分析凝膠上蛋白點(diǎn)的新方法，用于比較和分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組蛋白表達(dá)的差別，在重現(xiàn)性和靈敏度方面都優(yōu)于2DE技術(shù)。DIGE的原理是將要比較的2種蛋白質(zhì)樣品分別用不同波長的DIGE熒光染料(Cy2、Cy3、Cy5)進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記，將2個(gè)試驗(yàn)樣品與1個(gè)內(nèi)參標(biāo)同時(shí)在一塊凝膠上進(jìn)行電泳分離，內(nèi)參標(biāo)的應(yīng)用將有助于減少不同凝膠之間的差異，所得到的2D膠的圖像經(jīng)不同波長激光掃描后，得到不同顏色的熒光信號(hào)，并根據(jù)這些信號(hào)的比例來判斷樣品之間蛋白質(zhì)的差異，這樣既可避免匹配時(shí)出現(xiàn)

12、的誤差，在進(jìn)行定量分析時(shí)也不依賴于膠與膠之間的差異56。同時(shí)，DIGE第一次引入了內(nèi)參標(biāo)的概念，也是目前唯一用內(nèi)標(biāo)來衡量每一塊膠上每一個(gè)點(diǎn)的系統(tǒng)，由于每個(gè)蛋白點(diǎn)都有它自己的內(nèi)標(biāo)，并且分析軟件會(huì)根據(jù)每個(gè)蛋白點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，以確保DIGE定量結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和操作的重復(fù)性。除此之外，在靈敏度方面， DIGE可與銀染和SYPRO Ruby 相媲美,它可以對(duì)微量(少到5 g)樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，也可以檢測(cè)到樣品間<10%的蛋白表達(dá)差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度達(dá)到>95%7。目前，DIGE技術(shù)已經(jīng)成為具有較好應(yīng)用前景的定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法。筆者應(yīng)用DIGE差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),

13、對(duì)人髓系白血病細(xì)胞株HL60細(xì)胞和HL60/ADR細(xì)胞的整體蛋白表達(dá)譜進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)18種蛋白表達(dá)改變，其中有些可能參與耐藥機(jī)制的發(fā)生。通過本實(shí)驗(yàn)篩選出的表達(dá)下調(diào)的差異蛋白有：(1)L絲束蛋白。Verrills等報(bào)道，L絲束蛋白在長春新堿耐藥細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)8。這可能與其參與細(xì)胞的DNA修復(fù)功能有關(guān)。(2)myc上游結(jié)合元件蛋白。通過結(jié)合到myc啟動(dòng)子上游元件而調(diào)節(jié)myc的表達(dá)。(3)CGI46蛋白。具有ATPase活性，可以調(diào)節(jié)cmyc和E2F1依賴性的細(xì)胞凋亡9。而表達(dá)上調(diào)的差異蛋白主要有：(1)核仁素。核仁素?cái)嗔鸦虮磉_(dá)下調(diào)可以使它對(duì)bcl2 mRNA的穩(wěn)定作用減弱，或者通過斷裂片段

14、直接激活核酸內(nèi)切酶，使DNA發(fā)生斷裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。核仁素在細(xì)胞凋亡中的作用越來越突出，已被列為細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白中的一員10。(2)鈣網(wǎng)蛋白前體(CRT)。Kageyama等發(fā)現(xiàn)，大鼠H9c2成肌細(xì)胞過表達(dá)CRT，DNA雙鏈斷裂增加，Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑明顯受抑制，促進(jìn)分化依賴性細(xì)胞凋亡11。(3)線粒體絲氨酸蛋白酶體Htra 2。具有酪氨酸蛋白酶活性，能通過結(jié)合并抑制凋亡蛋白抑制物(BIRC)，提高caspase活性而誘導(dǎo)凋亡12。(4)泛素羧基末端酯酶L3。參與泛素化蛋白的加工。(5)ATP合成酶。ATP合成酶A鏈和線粒體ATP酶亞單位6對(duì)維持線粒體跨膜電位有重要作用，下調(diào)可使線粒體跨膜電位

15、下降，活化caspase3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。(6)核仁磷酸蛋白B23。主要參與核蛋白體的裝配和轉(zhuǎn)運(yùn)，并且增強(qiáng)B23的穩(wěn)定性可以提高它對(duì)細(xì)胞的抗凋亡的作用13。(7)Nm23蛋白?？稍黾幽[瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性14。(致謝：蛋白質(zhì)組學(xué)研究內(nèi)容在中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所蛋白質(zhì)組分析研究中心完成，特此表示感謝!)【參考文獻(xiàn)】1 Kourti M,Vavatsi N,Gombakis N,et al.Expression of multidrug resistance 1 (MDR1), multidrug resistancerelated protein 1 (MRP

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