培養(yǎng)基促生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)操作

1、大腸埃希菌 Escherichia coliATCC 8739制訂培養(yǎng)基靈敏度實(shí)驗(yàn)操作，是為了規(guī)范、統(tǒng)一培養(yǎng)基靈敏度檢測(cè)，確保微生物檢測(cè) 準(zhǔn)確、安全進(jìn)行。范圍適用于所有配制好并滅菌的培養(yǎng)基。編寫依據(jù)EP6.5術(shù)語職責(zé)QC衛(wèi)檢組人員負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、滅菌、靈敏度實(shí)驗(yàn)。內(nèi)容6.1 使用的設(shè)備、器具生物安全柜、無菌培養(yǎng)皿、無菌刻度吸管或無菌注射器、無菌玻璃涂布器、酒精燈等6.2 使用的菌株EP檢測(cè)用ATCC的菌株:金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 6538銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027枯草芽孢桿菌 Bacilllus

2、 subtilis ATCC 6633沙門氏菌 Salmonella enterica subsp ATCC 14028白色念珠菌 Candida albicansATCC 10231黑曲霉 Aspergillus nigerATCC 16404培養(yǎng)基靈敏度檢測(cè)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過 5代, 并采用適宜的菌種保藏技術(shù)， 以保證試驗(yàn)用菌株的生物學(xué)特性。6.3 檢測(cè)頻率每批配制、滅菌后的培養(yǎng)基均應(yīng)做靈敏度測(cè)試。6.4 操作方法6.4.1 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基用已經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明合格的培養(yǎng)基或購(gòu)買的有質(zhì)量證書的成品平皿培養(yǎng)基作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn) 培養(yǎng)基.6.4.2 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基將瓊脂類的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基加熱融化后，冷卻至

3、45 C左右，以無困的方式在無困培養(yǎng)皿中注入1520ml，備用。液體類的培養(yǎng)基直接使用。6.4.3 菌懸液的制備6.4.3.1 細(xì)菌菌懸液的制備方法一：取細(xì)菌的斜面培養(yǎng)物1耳匙接種在酪蛋白大豆消化肉湯培養(yǎng)基中 3035C培養(yǎng)1824h，取上述培養(yǎng)物用無菌水按10倍系列稀釋，分別制成10-710-8的菌懸液備用。6.4.3.2 霉菌菌懸液的制備取白色念珠菌的斜面培養(yǎng)物1耳匙接種在沙氏瓊脂斜面上于 2025C培養(yǎng)2448h,加入無菌水 4ml 制成原液，取上述原液按 10倍系列稀釋，分別制成 10-610-7的菌懸液備用。取黑曲霉的斜面培養(yǎng)物加入無菌水 4ml制成抱子懸液，取上述抱子懸液按10倍系

4、列稀釋，分別制成 10-610-7的菌懸液備用。方法二：直接用杭州微球生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品 -培養(yǎng)基靈敏度指示劑， 該產(chǎn)品已經(jīng)10100CFU試驗(yàn)0.1 0.5ml 的菌幫我們精確控制了細(xì)菌數(shù)量，只要直接拿稀釋液稀釋下就可以直接取到 菌。使用方便，數(shù)量精確。推薦用此方法操作。6.4.4 培養(yǎng)基的生長(zhǎng)促進(jìn)實(shí)驗(yàn)6.4.4.1 瓊脂類培養(yǎng)基的生長(zhǎng)促進(jìn)實(shí)驗(yàn)每株菌用 2 個(gè)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基平皿，用表面涂布法在每個(gè)平皿表面接種 懸液（約10100CFU式驗(yàn)菌），同時(shí)用2個(gè)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基平皿做對(duì)照，接種相同量的 菌懸液試驗(yàn)， 在規(guī)定溫度下培養(yǎng) , 取出平皿點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基上的微生物數(shù)量應(yīng)為對(duì) 照培養(yǎng)基

5、上微生物生長(zhǎng)數(shù)量的 70%-150%范圍內(nèi)。（注：每種培養(yǎng)基生長(zhǎng)促進(jìn)實(shí)驗(yàn)的具體菌株見附錄 1 ）6.4.4.2 液體類培養(yǎng)基的生長(zhǎng)促進(jìn)實(shí)驗(yàn)每株菌用2管（或瓶）實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，接種 0.10.5ml的菌懸液（約10100CFU式驗(yàn)菌），同時(shí)用 2個(gè)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基或用已知合格的酪蛋白大豆消化瓊脂平皿做對(duì)照，接種 相同量的菌懸液試驗(yàn)，在規(guī)定溫度下培養(yǎng) , 對(duì)比或計(jì)數(shù)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)能生長(zhǎng)菌落為合格。6.4.5 培養(yǎng)基的生長(zhǎng)促進(jìn)和抑制特性試驗(yàn)6.4.5.1 液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)促進(jìn)特性試驗(yàn)接種0.10.5ml的菌懸液（約10100CFU式驗(yàn)菌）于一定量適合的培養(yǎng)基。在特定 溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不超過試驗(yàn)中規(guī)定

6、的最短期限。與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基獲得的微生物 生長(zhǎng)相比，接種微生物的生長(zhǎng)應(yīng)明顯。6.4.5.2 固體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)促進(jìn)特性試驗(yàn)采用表面涂布法，在每一塊平皿上接種0.10.5ml的菌懸液（約10100CFU式驗(yàn)菌） 適宜微生物。在特定溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不長(zhǎng)于試驗(yàn)中規(guī)定的最短期限。接種微生物的 生長(zhǎng)與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基獲得的微生物生長(zhǎng)相當(dāng)。6.4.5.3 液體或固體培養(yǎng)基的抑制特性試驗(yàn)用適當(dāng)培養(yǎng)基接種至少100 CFU適宜微生物。在特定溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間至少為試驗(yàn)中規(guī)定的最長(zhǎng)期限。無受試微生物生長(zhǎng)。注：每種培養(yǎng)基生長(zhǎng)促進(jìn)和抑制特性試驗(yàn)的具體菌株見附錄 1） 7 附錄附錄 1 培養(yǎng)基生長(zhǎng)促進(jìn)和抑制特性

7、表 附錄 1：培養(yǎng)基的生長(zhǎng)促進(jìn)、抑制特性表培養(yǎng)基特性受試菌株培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)溫度酪蛋白大豆消化瓊脂生長(zhǎng)促進(jìn)金黃色葡萄球菌 3天30-35 C銅綠假單胞菌 3天30-35 C枯草芽抱桿菌 3天30-35 C白色念珠菌 5天30-35 C黑曲霉 5天30-35 C酪蛋白大豆消化肉湯生長(zhǎng)促進(jìn)金黃色葡萄球菌 3天30-35 C銅綠假單胞菌 3天30-35 C枯草芽抱桿菌 3天30-35 C沙氏匍萄糖瓊脂生長(zhǎng)促進(jìn)白色念珠菌 5天20-25 C黑曲霉 5天20-25 CR2A生長(zhǎng)促進(jìn)金黃色葡萄球菌 3天30-35 C銅綠假單胞菌 3天30-35 C枯草芽抱桿菌 3天30-35 C大腸埃希菌 3天30-35 C麥康凱肉湯生長(zhǎng)促進(jìn)大腸埃希菌 3天42-44 C抑制金黃色葡萄球菌 3天42-44 C麥康凱瓊脂生長(zhǎng)促進(jìn)大腸埃希菌 3天30-35 C氯化鎂孔雀綠沙門氏菌增菌液生長(zhǎng)促進(jìn)沙門氏菌 3天30-3