神經(jīng)聚乙二醇修飾?？窠?jīng)毒素rhk2a的分離與純化

1、神經(jīng)聚乙二醇修飾海葵神經(jīng)毒素rhk2a的分離與純化    本文由寫手聯(lián)盟-論文代寫代發(fā)表 收集整理發(fā)布，本站提供相關(guān)職稱論文發(fā)表服務。相關(guān)專業(yè)提示：乙二醇純化 神經(jīng)毒素 vx神經(jīng)毒素 vx神經(jīng)毒素制作 嗜神經(jīng)毒素 第八號神經(jīng)毒素 乙二醇 聚乙二醇 乙二醇丁醚 7 K- t5 |) , _) D, 2 C! i! w0 t- W( _# G5 e; U3 k                      

2、0;作者：黃慧,潘育方,郭曉娟,舒雅俊,楊帆 3 E% W. P3 , ?/ V【摘要】  目的 對聚乙二醇化?？窠?jīng)毒素(mPEG?rhk2a)修飾產(chǎn)物進行分離與純化。方法 將聚乙二醇(PEG)化反應所得混合產(chǎn)物超濾除鹽后，采用SP?650S強陽離子交換層析柱和CM?650S弱陽離子交換層析柱進行分離純化，收集不同NaCl離子濃度下的梯度洗脫液，經(jīng)超濾除鹽、冷凍干燥、SDS?PAGE電泳檢測，確定分離純化mPEG?rhk2a的色譜條件。結(jié)果 在保證mPEG?rhk2a穩(wěn)定性的前提下，隨著緩沖液pH值的降低，2種陽離子交換柱與mPEG?rhk2a的結(jié)合量均增加;在同一pH值

3、下，強陽離子交換柱的結(jié)合情況更好。用SP?650S強陽離子交換層析柱進行分離純化時，洗脫液中溶液電導率在57 ms/cm時,mPEG?rhk2a能被洗脫下來，而且鹽離子濃度梯度變化越緩，mPEG?rhk2a修飾產(chǎn)物各洗脫峰的分離度越高;用CM?650S弱陽離子交換層析柱進行分離純化時，修飾產(chǎn)物mPEG?rhk2a主要在穿透峰中出現(xiàn)。結(jié)論 使用SP?650S強陽離子交換層析柱，用pH 4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖液與含0.5 mol/L NaCl 的pH 4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖液(后者比例變化為0%50%)進行梯度洗脫，修飾產(chǎn)物mPEG?rhk2a與未修飾的rhk2a得

4、到了很好的分離。 ; D' Q4 ) X2 y0 W; s& l【關(guān)鍵詞】  聚乙二醇化?？窠?jīng)毒素;陽離子交換層析;分離;純化; B1 ' f( N( tAbstract:Objective To isolate and purify mPEG?rhk2a.Methods The mixture obtained from pegylated reactions was separated by Toyopearl SP?650 column for strong ion exchange and Toyopearl CM?650 column f

5、or weak cation exchange after desalted by ultrafiltration and the effluent of gradient elution was collected at various concentrations of sodium chloride,ultrafiltrated and freeze?dried,detected by SDS?PAGE electrophoresis to determine chromatographic condition of isolate and purify mPEG?rhk2a. Resu

6、lts With the preconditions of keeping mPEG?rhk2a stable and reduced pH of buffer solutions,the binding capacity of both cation exchange columns and mPEG?rhk2a increased. However,the capacity of the strong cation exchange was more than the week one. MPEG?rhk2a was eluted by Toyopearl SP?650 column fo

7、r strong cation exchange when the concentration of NaCl was in the range of 5%7%. The more slowly the concentration gradient changed,the higher of the resolution of diverse eluting peaks amongst modified products was. When using the Toyopearl CM?650 column for weak cation exchange,the mPEG?rhk2a mai

8、nly presented in penetration peaks. Conclusion The gradient elution was finished under the condition of 0.02 mol/L acetate buffer solution with pH 4.0 and the same acetate buffer solution (with the proportion change from 0% to 50%) containing 0.5 mol/L NaCl by using Toyopearl SP?650 column for stron

9、g cation exchage. The products including pegylated and unmodified rhk2a were successfully isolated,which has laid a foundation for our further research on the properties of purified mPEG?rhk2a., 6 Y( b' d7 N$ uKey words:mPEG?rhk2a; cation exchange column chromatography; isolation and purificatio

10、n- Q8 l. 4 e; K6 z" V0 x PEG修飾蛋白質(zhì)技術(shù)由于能夠在保證藥用蛋白活性的同時降低其在體內(nèi)的免疫原性和毒副作用，延長血漿半衰期，增強其化學穩(wěn)定性，增大溶解性，提高藥用蛋白在體內(nèi)的生物利用度，增加患者的順應性，已成功用于改善多種蛋白質(zhì)藥物的性質(zhì)。2000年中山大學生命科學院利用基因工程技術(shù)獲得一種重組?？窠?jīng)毒素rhk2a，其對心肌組織產(chǎn)生很強的正性肌力作用，在治療充血性心力衰竭方面有極好的應用前景。為解決海葵肽類毒素rhk2a臨床應用時存在穩(wěn)定性差、毒性較大等問題，本課題組將PEG修飾技術(shù)應用于rhk2a，通過對各種反應條件的優(yōu)化，得到了最佳工藝條件下的甲基聚

11、乙二醇(mPEG)修飾的?？窠?jīng)毒素產(chǎn)物mPEG?rhk2a。但在mPEG修飾rhk2a過程中，由于大部分mPEG與rhk2a的偶聯(lián)反應都是隨機性親核反應，所以偶聯(lián)修飾產(chǎn)物往往都是由多種不同的偶聯(lián)蛋白異構(gòu)體組成的混合物。本研究旨在對mPEG?rhk2a修飾產(chǎn)物進行分離與純化。1 v9 P' R  G5 u6 f1 t1 材料與儀器0 b1 M7 P) e4 A' A; zSP?650S強陽離子交換層析柱料、CM?650S弱陽離子交換層析柱料(日本TOSOH公司生產(chǎn)); Amicon TM Stirred Cell超濾裝置、再生纖維素超濾膜(截留分子量1000

12、)(美國Millipore公司);Biologic LP層析系統(tǒng)(美國Bio?Rad公司);BETA1?8K型冷凍干燥機(德國CHRIST公司);Delta320pH計(梅特勒?托利多公司)。4 |0 / e% ' 8 B2 實驗方法/ e: K6 p' ' H3 t/ o+ m' h+ n* 1 H' f將rhk2a按照最佳工藝條件修飾后得到的mPEG?rhk2a 修飾反應混合物， 用截流分子量為 1 000的超濾膜超濾除鹽，然后用被緩沖溶液平衡后的陽離子層析柱進行分離純化3,4，考察不同鹽離子濃度緩沖液的分離效果，收集各洗脫峰的流出液，將收集液超濾除

13、鹽后， 轉(zhuǎn)入50 mL離心管中， 于-80 下預凍34 h，在-35-20 下抽真空冷凍干燥24 h，所得產(chǎn)物用Tris?Tricine系統(tǒng)進行SDS?PAGE電泳檢測。% |. g  X& F$ f3 N2 w0 F0 z2.1 平衡、洗脫緩沖液pH值的選擇- u' M% a. B" p! F2.1.1 SP?650S強陽離子交換層析柱平衡、洗脫緩沖液pH值的選擇 取試管7支，各加 1 g SP?650S強陽離子交換層析柱料后，分別用純水洗滌，每次10 mL，洗5次?？紤]到mPEG?rhk2a的穩(wěn)定性5,6，各加入pH值分別為4.0、4.6、5.

14、0、5.4的醋酸鈉?醋酸緩沖液與pH值分別為6.0、6.5、7.0的磷酸鈉?磷酸緩沖液淋洗，每次10 mL，洗5次，待柱料平衡穩(wěn)定，在每管中加入2 mg 的mPEG?rhk2a，搖動試管515 min，靜置待柱料下沉，取每管上清液于280 nm下測定其紫外吸收值。: e. u& R+ T. H2.1.2 CM?650S弱陽離子交換層析柱平衡、洗脫緩沖液pH值的選擇 取試管7支，各加 1 g CM?650S弱陽離子交換層析柱料后，余下操作同“2.1.1”。# s1 i  X; y9 r0 Y$ |2.2 2種離子交換層析柱分離純化修飾產(chǎn)物的條件3 K% a2 H1 O

15、; S2 SP?650S強陽離子交換層析柱的規(guī)格為2.6 cm×4 cm(柱容量1 CV=25 mL)，柱平衡液為3 CV的pH4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖液，流速為1 mL/min，檢測波長為280 nm，色譜柱清洗液為5 CV 的0.5 mol/L NaOH溶液。CM?650S弱陽離子交換層析法的色譜條件同上。. k1 h3 - a* P/ bSP?650S強陽離子交換層析法用于梯度洗脫的緩沖液見表1;CM?650S弱陽離子交換層析法依次更換的洗脫液為NaCl含量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 mol/L 的pH 4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖

16、液各5 CV。( v. ?, - q8 J( t3 結(jié) 果" F: s1 n" n9 B4 h; P* T3.1 SP?650S強陽離子交換層析和CM?650S弱陽離子交換層析洗脫條件的選擇與比較表1 SP?650S強陽離子交換層析法所用的梯度洗脫液醋酸鹽緩沖液的比例第一組100%0%0%100%(20 CV)第二組前半段100%40%0%60%(20 CV)后半段40%0%60%100%(10 CV)第三組100%50%0%50%(20 CV)$ 7 e8 a5 : L6 y7 G3 v9 R( j) K1 D用一系列不同pH值的緩沖液平衡2種離子交換層析柱料，測得其相應

17、上清液的紫外吸收值，結(jié)果如表2所示，隨著緩沖溶液pH值的升高，上清液的紫外(UV)吸收值增加，即洗脫液中的蛋白質(zhì)含量增加;緩沖液的pH值越低，離子交換柱料與mPEG?rhk2a的結(jié)合量越大,在同一pH值下，SP?650S強陽離子交換柱料的mPEG?rhk2a結(jié)合情況優(yōu)于 CM?650S弱陽離子交換柱料。因此，選用pH4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖液平衡、洗脫2種層析柱，此時色譜柱有效交換容量最大，mPEG?rhk2a的分離效果相對較好。表2 不同pH值緩沖液下SP?650S與CM?650S柱料上清液的紫外吸收值$ r9 C- A/ V  T/ y 

18、60; </P>3.2 SP?650S強陽離子交換層析法分離修飾產(chǎn)物9 Z" t' 4 y" L+ J2 n! k& s用pH4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖溶液平衡SP?650S強陽離子交換柱后上樣,mPEG?rhk2a修飾反應所得混合產(chǎn)物依次采用鹽離子濃度梯度逐漸變緩的3組緩沖液進行洗脫，分離結(jié)果分別如圖1的A、B、C所示洗脫液中溶液電導率在57 ms/cm時，mPEG?rhk2a能被洗脫下來，鹽離子濃度梯度變化越緩，mPEG?rhk2a修飾產(chǎn)物各洗脫峰的分離度越高，則可將色譜圖3所對應的洗脫條件作為強陽離子交換層析法的最佳分離條件。7

19、 E7 V" T* p6 I# " : M$ f- 收集在最佳分離條件(第3組緩沖液洗脫)下的吸收峰、所對應的流出液，超濾除鹽、凍干，將分離產(chǎn)物進行SDS?PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖2所示：mPEG修飾產(chǎn)物與未修飾的rhk2a得到很好的分離，由各電泳條帶的分子量初步判斷，單修飾產(chǎn)物mPEG?rhk2a在峰中出現(xiàn)。6 N) ?- n' , T# y3.3 CM?650S弱陽離子交換層析法分離修飾產(chǎn)物* Z8 b, X  g' ?* '' o" ; T用pH 4.0的0.02 mol/L醋酸鹽緩沖溶液平衡CM?650

20、S弱陽離子交換柱后上樣，mPEG?rhk2a修飾反應所得混合產(chǎn)物，依次更換含NaCl鹽離子濃度不同的緩沖液進行梯度洗脫,結(jié)果如圖3所示,主要修飾產(chǎn)物被穿流洗出。收集圖3中吸收峰、所對應的流出液，超濾除鹽、凍干，將分離產(chǎn)物進行SDS?PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖4所示：mPEG?rhk2a修飾產(chǎn)物主要在穿透峰中出現(xiàn)，未修飾的rhk2a在0.1) i, i3 P$ F3 V) l1 d% O: 4 討 論9 P% M2 W' '# s% a由于mPEG?rhk2a偶聯(lián)蛋白異構(gòu)體除了分子量和表面電荷的細小差別之外，其他的理化性質(zhì)非常接近，因此偶聯(lián)產(chǎn)物的分離純化一直是蛋白質(zhì)PEG化技術(shù)的

21、難點之一。蛋白質(zhì)與PEG偶聯(lián)之后表面電荷會發(fā)生變化，利用這種電荷差異可以將偶聯(lián)蛋白分離，故國內(nèi)外多采用離子交換層析法分離PEG修飾混合物7。5 " F. o3 v  p! : m; nrhk2a中N?末端氨基與mPEG共價結(jié)合后，失去與氫質(zhì)子的結(jié)合能力，蛋白質(zhì)分子中的正電荷會減少，因此mPEG?rhk2a的等電點比rhk2a低。另一方面，由于mPEG長鏈會阻礙rhk2a與離子交換劑之間的電荷相互作用，即產(chǎn)生立體屏蔽作用，導致mPEG?rhk2a在離子交換層析中的流出行為與rhk2a有所不同。這兩方面因素決定采用離子交換層析法能夠分離純化mPEG?rhk2a修飾反應

22、混合物7。% V: c& q, I- f/ |# R由于陰離子交換樹脂結(jié)合的主要是蛋白質(zhì)的羧基，受氨基修飾影響較小，因而選擇陽離子交換樹脂分離純化mPEG?rhk2a。本文實驗結(jié)果也證明，用強陽離子交換層析法分離mPEG?rhk2a修飾反應混合物時，修飾產(chǎn)物mPEG?rhk2a在柱上的保留時間比未修飾的rhk2a要短。說明mPEG修飾確實降低了rhk2a的等電點，屏蔽了rhk2a與離子交換劑之間的靜電作用，使得在相同pH值條件下，修飾產(chǎn)物在柱上的吸附能力較弱。2 Y) J- 7 c0 f1 p: Z& I; L用弱陽離子交換層析法分離mPEG?rhk2a時，mPEG?rhk2a

23、修飾產(chǎn)物主要在穿透峰中出現(xiàn)，是因為mPEG修飾顯著地降低了mPEG?rhk2a的等電點，導致弱陽離子交換層析柱對mPEG?rhk2a的結(jié)合力太弱，無法獲得理想的分離效果。- _3 w' h7 7 I, i3 Y本研究證明，修飾產(chǎn)物mPEG?rhk2a,在平衡液的pH值為4.0時，與SP?650S強陽離子交換層析柱有良好的結(jié)合;在洗脫液中溶液電導率在57 ms/cm時，可被洗脫下來，并且與未修飾的rhk2a分離度良好，因此獲得了純度較高的mPEG?rhk2a，為下一步的深入研究奠定了基礎(chǔ)。9 5 - r9 O* J2 X: D" y【參考文獻】9 x, T9 P  % W# 0 m9    黃慧,潘育方,楊帆,等.海葵神經(jīng)毒素藥理作用研究進展J.宜春學院學報,2008,30(2):127-129.# W6 A& 4 , 3   h/ R6 % G1 * K6 b 楊帆,潘育方,黃慧,等.重組?？窠?jīng)毒素rhk2a的修飾產(chǎn)物、其修飾方法及應用:中國,20