白細胞介素-4基因修飾Raji細胞促進腫瘤特異細胞毒性T細胞

1、    白細胞介素-4基因修飾Raji細胞 促進腫瘤特異細胞毒性T細胞殺傷活性        【摘要】目的探討人白細胞介素(IL)-4基因修飾對伯基特淋巴瘤細胞株Raji的體外生物學特性、腫瘤特異性細胞毒性T細胞（CTL）殺傷活性的影響及其機制。方法采用逆轉錄病毒介導基因轉染法將人IL-4 cDNA導入Raji株并篩選獲得高效價表達IL-4的克隆，觀察IL-4表達克隆形態(tài)學特征、體外增殖反應及其誘導的外周血單個核細胞(PBMC)增殖反應和IL-2、干擾素(IFN-)

2、基因表達及CTL殺傷活性。結果IL-4基因修飾對Raji的體外生物學特性無明顯影響，但明顯促進正常人PBMC增殖及IL-2、IFN-基因表達，其誘導建立的CTL殺傷活性明顯增強，效應細胞：靶細胞比例為301時，IL-4基因修飾可使Raji細胞誘導的CTL殺傷活性上升23倍。結論外源性IL-4基因表達產物可能作用于瘤細胞和（或）PBMC，通過誘導IL-2、IFN-等細胞因子促進 CTL反應，并增強其殺傷活性?！娟P鍵詞】白細胞介素-4伯基特淋巴瘤基因T淋巴細胞，細胞毒性 Stimulation with IL-4 gene modified Raji cells enhances killing

3、activity of tumor-specific cytotoxic T lymphocyteZHAO Xiaodong, LI Chengrong, YANG Xiqiang, et al. Childrens Hospital, Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400014【Abstract】ObjectiveEffects of interleukin-4 (IL-4) gene modification of biological characteristics of Raji cell line and kil

4、ling activity of Raji-specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) were investigated. MethodsIL-4 cDNA was amplified from a plasmid, pCD-hIL-4, by polymerase chain reaction (PCR) and transferred into Raji cells via retrovirus-mediated gene transfection method. Proliferation of IL-4-producing Raji clones an

5、d PBMC, IL-2 and IFN- mRNA synthesis and killing activity of Raji cell-induced CTL were determined. ResultsStimulation with IL-4 gene-modified Raji cell increased proliferation and IL-2, IFN- mRNA synthesis of normal PBMC, which could not be blocked by anti-IL-4 monoclonal antibody. The killing acti

6、vity of CTL induced by IL-4 gene modified Raji clones was much stronger than that of controls. ConclusionIL-4 gene modification is capable of enhancing killing activity of Raji-specific CTL by means of up-regulating expression of IL-2 and creating a more suitable environment for antigen-presenting,

7、establishment and maintenance of killing function of CTL.【Key words】Interleukin-4Burkitts lymphomaGenesT-lymphocytes, cytotoxic惡性淋巴瘤在兒科臨床實踐中并不少見，目前的治療手段尚未取得令人滿意的效果。采用細胞因子基因修飾的腫瘤細胞疫苗激發(fā)機體抗腫瘤免疫功能，最終徹底清除腫瘤是一種具有潛在臨床價值的新方法。將其與手術切除、放療、化療結合進行治療可望大大改善惡性淋巴瘤患兒的預后。本研究將白細胞介素(IL-4)基因導入伯基特（Burkitt）淋巴瘤株Raji，觀察其體外生物

8、學特性的改變及對 T細胞功能的影響，旨在為惡性淋巴瘤的基因與免疫治療提供新線索。材料及方法一、目的基因、載體及宿主菌以含人IL-4 cDNA全序列的質粒PCD-hIL-4為模板，用引物Sense 5-AACTCGAGTTAATGGGTCTCA CCTCCCAA-3和Antisense 5-AGGGATCCTATTCAG CTCGAACACTTTGA-3通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增獲得IL-4 cDNA片段，瓊脂糖凝膠電泳回收、純化該片段。用雙脫氧鏈終止法測序。逆轉錄病毒載體(PLXSN)由Miller(USA)贈送，長約 5 900堿基對。宿主菌大腸桿菌Mc 1 061株由作者單位的免疫室保

9、存。二、主要試劑、細胞株及其來源內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶及逆轉錄酶均購自Promega公司；脫氧三磷酸核苷(dNTP)、Polybrene、細胞培養(yǎng)基RPMI 1 640、DMEM和克隆篩選試劑G 418購自Gibco公司；脂質體轉染試劑Dosper及重組IL-4購自Boehringer Mannheim公司；51鉻酸鈉(51Cr)購自美國Ameshan公司, 3H-TdR購自中國同位素公司，IL-2、干擾素(IFN-) PCR引物購自上海細胞生物研究所；重組 IL-4（rIL-4）、鼠抗人IL-4單克隆抗體及IL-4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自 Gen

10、zyme公司。病毒包裝細胞株PA317及病毒滴度鑒定細胞株 NIH3T3來自第三軍醫(yī)大學分子生物室， Raji為本室常規(guī)傳代培養(yǎng)。三、重組逆轉錄病毒載體的構建、包裝、篩選及感染人IL-4重組逆轉錄病毒載體構建策略如1所示。1IL-4重組逆轉錄病毒載體構建示意堿裂解法抽提質粒，酶切、連接、鑒定及細菌轉化等步驟均按 Sambrook等1介紹的標準方法操作。具體步驟為：用平端內切酶 HpaI使載體線性化。酚：氯仿抽提純化后與 PCR反應擴增回收得到的目的基因片段，在T4 DNA連接酶催化作用下進行連接反應。連接反應產物轉化感受態(tài)大腸桿菌-Mc1 061，將其接種于瓊脂平板，待菌落形成后進行大腸桿菌擴

11、增，抽提質粒，酶切后瓊脂糖電泳鑒定。脂質體介導基因轉染、病毒滴度鑒定及感染 Raji細胞方法見參考文獻2。四、表達IL-4的Raji細胞克隆篩選及體外生物學特性觀察用G 418篩選轉基因 Raji細胞克隆1個月，收集抗性細胞克隆上清液用ELISA法檢測IL-4表達水平。在普通光學顯微鏡下觀察抗性Raji克隆形態(tài)學特征，用3H-TdR摻入法測定其體外增殖活性。五、Raji細胞誘導正常人外周血單個核細胞（PBMC）增殖及IL-2、IFN-基因表達常規(guī)分離正常人PBMC，調細胞濃度至1×106/ml，加100 l入55孔板，不同組別加入經絲裂霉素C(40 g/L×106細胞，37

12、，1小時)處理的轉基因或對照 Raji細胞。 IL-4單克隆抗體(簡稱單抗)阻斷組加入終濃度為0.5 g/ml的鼠抗人 IL-4單抗,重組 IL-4組加入終濃度為0.1 g/ml的IL-4，37、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結束前16小時加入3H-TdR，液閃計數每分鐘脈沖數(cpm)值。另取1×106 PBMC加入24孔板，分別加入絲裂霉素C處理的腫瘤細胞1×105/孔（100 l），置37、5%CO2孵箱中培養(yǎng)12、24、48和72小時后抽提總RNA，用RT-PCR檢測IL-2和IFN-基因表達。六、Raji特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)建立及其殺傷活性

13、測定參照Thomas等3介紹的方法。用 51Cr標記野生型腫瘤細胞（100 ci/1×106細胞，37過夜），PBS緩沖液洗滌3次后將濃度調至1×105/ml作為靶細胞。采用4小時 51Cr釋放法測定CTL殺傷活性。于96孔培養(yǎng)板中加入不同比例的效應細胞和靶細胞（每種比例重復3孔），37、5%CO2孵育4小時，1 500 r/min離心5分鐘，收集上清用-計數儀測定其cpm值。按下式計算CTL殺傷活性，以殺傷率%表示：%殺傷活性=×100結果一、重組IL-4逆轉錄病毒載體的構建用核酸內切酶SacI消化載體出現(xiàn)2片段，消化重組體后2片段大小相近，無法區(qū)分；DNA內切

14、酶EcoR消化重組體出現(xiàn)367 bp小片段，消化載體后無此片段出現(xiàn)，證實正向重組的 IL-4逆轉錄病毒構建成功（2）。2重組IL-4逆轉錄病毒載體酶切鑒定譜二、Raji株表達 IL-4水平及其體外生物學特征各株Raji細胞克隆IL-4表達水平如表1所示。導入IL-4cDNA的Raji細胞產生IL-4的最高水平24小時可達134.5 pg/106細胞。普通光學顯微鏡下觀察IL-4高表達克隆細胞形態(tài)、大小與野生型Raji及僅導入載體的Raji細胞(Raji-neo)相比無明顯變化。其體外增殖反應水平與對照組比較亦無明顯差異。表1Raji細胞表達IL-4水平及其體外增殖反應細胞株IL-4表達水平(p

15、g/106細胞24h)增殖反應(cpm)未加組rIL-4組野生型Raji02 2132 376Raji-neo02 4372 643R-IL-412 678-R-IL-422 734-R-IL-432 765-R-IL-441 988-注：-示未檢測；每一實驗至少重復3次；R-IL-414示IL-4基因修飾的Raji株，下同三、Raji細胞誘導的正常人PBMC增殖反應如表2所示，表達IL-4的4株Raji克隆誘導的正常人PBMC增殖反應明顯強于野生型Raji及Raji-neo誘導者，IL-4單抗不能阻斷。重組人IL-4加入培養(yǎng)系統(tǒng)雖可使PBMC增殖反應增強，但其程度遠不及表達IL-4的Raji

16、克隆。表2Raji細胞誘導的正常人PBMC體外增殖反應(cpm)誘導細胞株未加組IL-4單抗組rIL-4組空白對照412-564野生型Raji619-1 386Raji-neo546-1 748R-IL-413 8653 647-R-IL-423 4673 282-R-IL-433 1803 254-R-IL-442 7892 403-四、Raji細胞誘導正常人PBMC IL-2、IFN-基因表達IL-4基因修飾的Raji細胞可誘導正常人PBMC IL-2和IFN-基因表達。IL-2基因表達在刺激后12小時即可檢測，維持至48小時開始減弱；IFN-基因刺激后12小時有較弱表達，至24小時達表達

17、高峰，48小時后開始減弱（3、4）。野生型Raji、Raji-neo、加入rIL-4共培養(yǎng)的Raji及單獨加入rIL-4均未能誘導上述基因表達。 1：Raji-rIL-4；2：Raji-neo；3：R-IL-4，24h；4：R-IL-4；5：Marker3R-IL-41誘導的正常人PBMC IL-2基因表達1：Raji+rIL-4；2：Raji-neo；3：R-IL-4，24h；4：R-IL-41；12h；5：Marker4R-Il-41誘導的正常人PBMC IFN-基因表達五、CTL的殺傷活性野生型Raji細胞和Raji-neo僅能誘導輕度CTL殺傷活性。各種效應細胞：靶細胞比例兩者誘導的殺

18、傷活性無顯著差異。R-IL-41細胞誘導的CTL殺傷活性明顯增強，并隨效應細胞：靶細胞比例的升高而增強效應細胞靶細胞比例為301時Raji-neo、野生型Raji及R-IL-41誘導的CTL殺傷效率分別為(20.3±6.2)%、(20.8±4.3)%和(48.8±10.4)%。 討論細胞因子與機體抗腫瘤免疫反應密切相關，已證實諸多細胞因子在腫瘤局部表達可激發(fā)機體抗腫瘤免疫反應，提示細胞因子基因修飾腫瘤疫苗具有潛在的臨床應用前景。 IL-4是一種具有多種生物學功能的細胞因子，前期研究發(fā)現(xiàn) IL-4基因修飾的小鼠實體瘤細胞可增強宿主的抗腫瘤免疫反應4；重組 IL-4可

19、明顯抑制新鮮分離的非何杰金淋巴瘤細胞體外增殖反應5，提示 IL-4既可能直接作用于腫瘤細胞，抑制其增殖或促進其細胞凋亡過程6，亦可上調機體抗腫瘤免疫反應。本研究發(fā)現(xiàn) IL-4基因修飾 Raji細胞誘導的正常人PBMC增殖反應及 IL-2， IFN-基因表達明顯增強，而加入培養(yǎng)系統(tǒng)的重組 IL-4卻無此作用。提示由腫瘤細胞自分泌的 IL-4可能更有效地作用于瘤細胞本身和(或) PBMC，最終促進PBMC增殖并表達一些有利于抗原提呈、 CTL反應建立及 CTL殺傷活性的細胞因子產生，從而有利于機體有效清除腫瘤。IL-2能促進 T細胞增殖，誘導 T細胞分泌一系列細胞因子，亦為CD8+CTL維持殺傷活

20、性必需的生長因子，故推測其可能為 IL-4基因修飾瘤苗促進 CTL殺傷活性的關鍵作用環(huán)節(jié)。IL-4主要來源于TH2細胞，具有誘導T細胞向TH2方向分化并產生TH2類細胞因子的功能。本研究發(fā)現(xiàn)IL-4基因修飾瘤苗主要誘導正常人PBMC產生 IL-2、 IFN-等TH1細胞類細胞因子, 而用rIL-4或rIL-4加腫瘤細胞則未能誘導PBMC產生上述細胞因子, 提示腫瘤細胞分泌的 IL-4可能并未直接作用于 T細胞。我們推測IL-4基因修飾 Raji細胞所致的繼發(fā)因素,如腫瘤細胞膜表面某些抗原的改變, 可能激活 T淋巴細胞受體, 從而誘導建立TH1應答。 CTL是抗腫瘤免疫網絡中最特異、最重要的效應細胞，本研究結果為 IL-4基因修飾淋巴瘤疫苗的使用提供了線索，但尚需在體內進一步證實。本課題為國家自然科學基金資助（編號：39470733）及衛(wèi)生部科研課題基金資助（編號：96-1-366）作者單位：400014 重慶醫(yī)科大學兒童醫(yī)院參考文獻1Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press