血小板第4因子對(duì)急性放射損傷小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用(1)

1、    血小板第4因子對(duì)急性放射損傷小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用(1)    】 目的： 探討血小板第4因子(platelet factor 4, PF4)對(duì)小鼠5.0 Gy 射線全身照射后骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cell, BMSC）的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討PF4對(duì)造血的輻射防護(hù)機(jī)制. 方法： 40只雄性小鼠隨機(jī)分為4組： 單純放射組（R）， 放射PF4組（R P）， 正常PF4組（N P）， 正常對(duì)照組（N）. 小鼠照射前分別于26和20 h ip PF4，每次劑量50 g/ kg.

2、于照射后3 d取BMSC體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，并于培養(yǎng)10 d后用流式細(xì)胞儀測(cè)定貼壁細(xì)胞的細(xì)胞周期和DNA含量，免疫組化（SP法）檢測(cè)細(xì)胞p27kip1表達(dá). 結(jié)果： 放射損傷小鼠BMSC 24 h貼壁率4組依次為37, 58%, 74%, 79.3%；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明R組G0 G1期細(xì)胞顯著高于其余3組，而G2 M期細(xì)胞顯著低于其余三組，DNA含量顯著低于其余3組；R組p27kip1表達(dá)明顯強(qiáng)于其余3組. 結(jié)論： PF4對(duì)放射損傷的BMSC有保護(hù)作用，可能與抑制p27kip1表達(dá)有關(guān).【關(guān)鍵詞】 骨髓基質(zhì)細(xì)胞；血小板因子4；輻射損傷；輻射防護(hù)；p270引言造血功能

3、障礙是放射損傷時(shí)最基本的病理變化. 此時(shí)的造血功能障礙涉及造血干/祖細(xì)胞和造血基質(zhì)細(xì)胞損傷. 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cell, BMSC)是造血誘導(dǎo)微環(huán)境(hematopoietic inductive microenvironment, HIM)的重組成成分. 血小板第4因子(PF4)能可逆地抑制造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞的生長(zhǎng)，又是骨髓細(xì)胞調(diào)節(jié)的負(fù)調(diào)節(jié)因子,并因此而保護(hù)骨髓造血干祖細(xì)胞免受輻射和細(xì)胞毒劑的損傷1，2. 在本實(shí)驗(yàn)中我們首次以體外培養(yǎng)放射損傷小鼠的BMSC為基礎(chǔ)，觀察PF4對(duì)其的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討PF4對(duì)放射損傷的保護(hù)機(jī)制.1材料和方法BABL/c健康

4、雄性小鼠40只，體質(zhì)量2224 g，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco）；PF4（Sigma）：用雙蒸水稀釋成工作液,置4冰箱保存?zhèn)溆?稀釋濃度為100 mg/L；特級(jí)小牛血清、馬血清（杭州，四季青）；胰酶（Sigma）；P27kip1, SP試劑盒及DAB顯色試劑盒（武漢博士德）.1.2方法 60Co 射線一次全身均勻照射,吸收劑量為5.0 Gy,吸收劑量率為 221.09 cGy/min，距離100 cm. 實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分4組，每組10只小鼠： 單純放射組（單放組，R）： 5.0 Gy 60Co 射線全身照射；放射PF4組（R P）： 放射前26和20 h給予PF

5、4 ip，50 g/kg，照射方式和劑量同組；正常PF4組（NP）：PF4注射時(shí)間及劑量同組，但不照射；正常對(duì)照組（N）： 不照射及PF4注射. BMSC原代培養(yǎng)參照Dexter方法3： BABL/c小鼠頸椎脫位處死,在無(wú)菌條件下分離雙側(cè)股骨,沖洗骨髓腔,制成單細(xì)胞懸液. RPMI1640培養(yǎng)體系中含100 mL/L新生牛血清，150 mL/L馬血清，青、鏈霉素100 kU/L, 1 mol/L氫化考的松, 50 mL/L CO2飽和濕度,37條件下擴(kuò)增BMSC. 第1次3 d后半量換液，以后每隔5 d半量換液. 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞形態(tài). 取25 mL的培養(yǎng)瓶，各組6個(gè)，接種

6、細(xì)胞5×105/瓶，每4 h取1瓶，倒去培養(yǎng)液，2.5 g/L胰酶消化，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞，計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的貼壁率（貼壁率已貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%）. 將各組BMSC用2.5 g/L胰酶消化后生理鹽水制成單細(xì)胞懸液，700 mL/L乙醇固定,溴化丙啶染色,用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和DNA含量. 另p27kip1表達(dá)的免疫組化染色（SP法）：BMSC 2×109/L 接種于孔底預(yù)先鋪好1 cm2經(jīng)過(guò)酸處理過(guò)的細(xì)胞玻璃爬片的24孔板，經(jīng)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后取出玻片，950 mL/L乙醇固定，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作. 行HE染色對(duì)照. 用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照.

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以x±s表示，使用SPSS10.0軟件，均數(shù)間差別用單因素方差分析，均數(shù)間多重比較使用LSDt檢驗(yàn).    2結(jié)果2.1BMSC形態(tài)和貼壁率剛接種的BMSC呈圓形，大小不一；d 3更換培養(yǎng)液時(shí)，各組細(xì)胞形態(tài)有差別：R組貼壁細(xì)胞數(shù)量較少，無(wú)成纖維樣細(xì)胞形成；RP組可見散在分布的貼壁細(xì)胞克隆，有成纖維樣細(xì)胞出現(xiàn)；N P組細(xì)胞形態(tài)多樣，呈三角形、圓形、成纖維樣；N組細(xì)胞形態(tài)同N P組. 710 d，R組散在分布貼壁細(xì)胞克隆，形態(tài)以圓形為主，少量成纖維樣；R P組成纖維樣細(xì)胞數(shù)量明顯多于R組；NP組成纖維樣細(xì)胞明顯增多，呈集落樣生

8、長(zhǎng)；N組成纖維樣細(xì)胞較NP組多，且連接成片. 4組BMSC 24 h貼壁率依次為R組37%，R P組58%，N P組74%，N組79.3%.            作者：高瑛，楊嵐，田瓊，方恒虎，聶蕾，劉水冰，衛(wèi)張蕊【關(guān)鍵詞】骨髓基質(zhì)細(xì)胞Protective effects of platelet fact         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論

9、文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。2.2細(xì)胞周期和DNA含量R組的G0 G1期細(xì)胞顯著高于R P組，G2 M期細(xì)胞顯著低于R P組；而N P組與N組均無(wú)顯著差異. DNA含量R組明顯低于其余3組（Tab 1）.表15.0 Gy照射后BMSC的細(xì)胞周期和DNA含量（略）2.3p27kip1蛋白表達(dá)胞質(zhì)可見彌漫散在棕色顆粒為p27kip1蛋白陽(yáng)性表達(dá),胞核無(wú)陽(yáng)性表達(dá). R組胞質(zhì)棕色顆粒較其余3組明顯多，即p27kip1過(guò)度表達(dá)(Fig 1).    3討論造血微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生

10、各種損傷時(shí),則有可能對(duì)維持正常的造血過(guò)程產(chǎn)生不同程度的影，且一旦受到損傷,其功能障礙和(或)其增殖能力損傷的修復(fù)甚為困難,機(jī)體造血功能的恢復(fù)也必然受到嚴(yán)重的影響. 因此,在輻射損傷引起的嚴(yán)重造血障礙中,基質(zhì)細(xì)胞的功能障礙可能起著非常重的作用4. 一般認(rèn)為,造血基質(zhì)細(xì)胞的輻射敏感性低于造血干細(xì)胞. 本實(shí)驗(yàn)提示： PF4可能具有保護(hù)基質(zhì)細(xì)胞的黏附功能的能力5.對(duì)于放射損傷后骨髓基質(zhì)細(xì)胞周期分析的研究報(bào)道很少,而有關(guān)PF4對(duì)其影響的研究更缺乏可比性的資料. 在本實(shí)驗(yàn)中，R組G0 G1期細(xì)胞顯著高于其余3組，說(shuō)明放射損傷使BMSC產(chǎn)生了 “G1期阻滯” ；同時(shí)輻射對(duì)DNA直接造成了損傷，使BMSC D

11、NA含量減少；而R P組S期細(xì)胞增加，這同Kitajima等6的研究結(jié)果相同. 也同PF4對(duì)造血細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制相同，將細(xì)胞阻滯于S期7.p27可抑制多種cyclinCDK 復(fù)合物的活性, 對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)調(diào)控. 我們發(fā)現(xiàn)該蛋白在R組高表達(dá)，且陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，而R P組的表達(dá)與其它組有顯著差異，這與放射損傷造成R組基質(zhì)細(xì)胞“G1期阻滯”相一致. 另外，我們還發(fā)現(xiàn)PF4對(duì)正常BMSC無(wú)明顯的保護(hù)作用. 總之本研究證實(shí)了放射損傷對(duì)BMSC “G1期阻滯”，闡明了PF4對(duì)放射損傷的BMSC的保護(hù)機(jī)制，也進(jìn)一步證實(shí)了基質(zhì)細(xì)胞在造血防護(hù)中的重地位，為臨床造血防護(hù)的治療方案提供幫助.【參考文獻(xiàn)】1 田瓊，

12、楊嵐，張發(fā)科，等. 血小板第4因子對(duì)小鼠急性照射小鼠造血保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究J. 中華血液學(xué)雜志，2000;20（6）:416-418.Tian Q, Yang L, Zhang FK, et al. Protective effect of platelet factor 4 on acute hematopoietic radiation injury in mice and its mechanism J. Chin J Radiol Med Prot, 2000；20（6）：416-418.2 楊嵐，宋俊玲，田瓊. 血小板第4因子造血保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究J. 西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2003；2

13、4（3）：188-190.Yang L, Song JL, Tian Q. Hemaprotective effects of platelet factor 4(PF4) J. Med J NDFNC, 2003；24(3)：188-190.3 Dexter TM, Moore MAS, Sheridan APC. Maintenance of he mapoietic stem cells and production of differentiated progeny in allogeneic and semi allogeneic bone marrow chimeras in vi

14、tro J. J Exp Med, 1977;145(6):1612.4 Ueno H, SakitaIshikawa M, Morikawa Y, et al. A stromal cellderived membrane protein that supports hematopoietic stem cells J. Nat Immunaol, 2003;4(5):457-463.5 Han P, Guo XH, Story CJ. Enhanced expansion and matuation of megakaryocytic progenitors by fibronectin J. Cytotherapy, 2002;4(3):277-283.6 Kitajima K, Kojima M, Kondo S, et al. A role of yumo