轉(zhuǎn)染外源HCAP1基因?qū)aji細(xì)胞化療敏感性的作用

1、轉(zhuǎn)染外源HCAP1基因?qū)aji細(xì)胞化療敏感性的作用【摘要】目的 探討外源HCAP1基因產(chǎn)物對B淋巴瘤/白血病細(xì)胞系Raji細(xì)胞化療敏感性的作用。方法 用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，把HCAP1基因轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，分別與化療藥物DNR(daunorubicin，柔紅霉素)、VP16（etoposide，足葉乙甙）和VCR（vincristine,長春新堿）聯(lián)合培養(yǎng)24小時(shí)，用苔盼蘭拒染試驗(yàn)計(jì)數(shù)活細(xì)胞。結(jié)果 轉(zhuǎn)染HCAP1的Raji細(xì)胞，在不同濃度的DNR（0.0110.0g/ml）和VP16（580g/ml）作用下，與轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞比較，細(xì)胞活力的抑制作用明顯增強(qiáng)(P0.05

2、)、IC50（半數(shù)抑制濃度）值明顯降低；但與不同濃度的VCR（12.5100g/ml）作用，細(xì)胞活力的抑制和IC50值與對照細(xì)胞相似。結(jié)論 HCAP1過表達(dá)可明顯增加Raji細(xì)胞對DNR、VP16作用的敏感性，但不能顯著增加對VCR作用的敏感性。 【關(guān)鍵詞】 HCAP1基因 基因轉(zhuǎn)染 細(xì)胞活力 Raji細(xì)胞 HCAP1（Hepatocellular Carcinoma Associated Protein1，也稱HC56）基因克隆于人類染色體17p13.31，此區(qū)域在多種腫瘤中呈雜合性缺失( loss of heterozygosity, LOH)，尤其以肝癌病人較為明顯，其LOH頻率可高達(dá)6

3、5%。HCAP1基因的cDNA全長為4750bp，編碼蛋白由1047個(gè)氨基酸組成。HCAP1基因產(chǎn)物在體外可明顯抑制肝癌細(xì)胞系Hep3B和SMMC7721細(xì)胞的生長2,3。 外源HCAP1基因過表達(dá)可顯著抑制白血病/淋巴瘤細(xì)胞系K562、Raji和Jurkat細(xì)胞的生長4，5。本研究中，我們把HCAP1的cDNA導(dǎo)入Raji細(xì)胞，利用pCMVscript載體中的新霉素(neo)抗性基因，用抗生素G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)外源HCAP1的細(xì)胞，分別與化療藥物VP16、DNR和VCR作用，觀察外源HCAP1基因過表達(dá)與化療藥物有無協(xié)同作用。 1 材料與方法 1.1 材料 HCAP1基因克隆于pCMVs

4、cript載體，此重組質(zhì)粒、pCMVscript空載體質(zhì)粒和HCAP1抗體由上海市腫瘤所癌基因與相關(guān)基因國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。DMEM培養(yǎng)基、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000和G418為美國BRL/Gibco公司產(chǎn)品。VP16和VCR為江蘇恒瑞醫(yī)藥公司產(chǎn)品，DNR為法馬西亞公司產(chǎn)品。Western blot的化學(xué)發(fā)光底物L(fēng)umiphosTM WB為美國Pierce公司產(chǎn)品。 1.2 質(zhì)粒DNA制備 HCAP1/pCMVscript重組質(zhì)粒和pCMVscript載體質(zhì)粒在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增后，用德國QIAfilterTM Plasmid Midi kit按說明書上的方法提取DNA，紫外分

5、光光度儀定量；并以EcoR/Kpn雙酶切，瓊脂糖電泳鑒定酶切產(chǎn)物。 1.3 HCAP1基因轉(zhuǎn)染及G418篩選 取指數(shù)生長期的Raji細(xì)胞，分轉(zhuǎn)染HCAP1基因和pCMVscript空載體兩組。接種于24孔板，每孔細(xì)胞數(shù)3105，懸浮于無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基，加入含1g cDNA和7.5l的LipofectmineTM2000混合液，調(diào)整細(xì)胞體積為0.2ml，培養(yǎng)5h后,加入含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基0.8ml。24h后，改用含G418（600g/ml）培養(yǎng)基，21d，同時(shí)用G418篩選的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞已全部死亡。用含G418（300g/ml）的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)G418抗性細(xì)胞。

6、 1.4 Western blot檢測HCAP1蛋白的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染HCAP1基因和空載體、并經(jīng)G418篩選的Raji細(xì)胞，及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的Raji細(xì)胞，用去污劑裂解緩沖液（50mmol/L Tris,HCl pH8.0、150mmol/L NaCl、0.1%SDS、100g/ml PMSF、1g/ml Aprotinin、1% NP40）裂解細(xì)胞。Bradform法定量總蛋白。取100g的蛋白質(zhì)，SDS聚丙酰胺電泳，200V，45min后，用BioRad公司的蛋白印跡儀將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，按次序用一抗（兔抗人HCAP1蛋白抗體）和二抗（鼠抗免IgGHRP）作用，最后與化學(xué)發(fā)光底物L(fēng)umiph

7、osTM WB作用3min，X光膠片爆光。 1.5 轉(zhuǎn)染外源基因的細(xì)胞與藥物的作用 取轉(zhuǎn)染HCAP1、轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染3種細(xì)胞，接種于96孔板，分別與不同濃度的VP16（0、5、10、20、40、80g/ml）、DNR（0、0.01、0.1、1.0、10.0g/ml）和VCR（0、12.5、25、50、100g/ml）孵育，每組設(shè)重復(fù)3孔，每孔起始細(xì)胞數(shù)為1105，24h后，用臺盼蘭拒染試驗(yàn)計(jì)數(shù)活細(xì)胞。計(jì)算以下參數(shù)： 細(xì)胞活力藥物濃度為N時(shí)的活細(xì)胞數(shù)/藥物濃度為0時(shí)的活細(xì)胞數(shù)100 半數(shù)抑制濃度(IC50)：采用概率單位法PROBIT（Probability unit）。 16 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

8、細(xì)胞活力、 IC50實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析。 2 結(jié)果 2.1 外源HCAP1基因在Raji細(xì)胞的表達(dá) 同樣100g 的總蛋白經(jīng)Western blot檢查發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染HCAP1基因的Raji細(xì)胞HCAP1蛋白表達(dá)量明顯增加（圖略）。提示外源HCAP1基因已在Raji細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)。 2.2 外源HCAP1基因與化療藥物聯(lián)合對Raji細(xì)胞活力的作用 轉(zhuǎn)染HCAP1的Raji細(xì)胞在0、0.1、1.0、10.0g/ml 4種濃度的DNR作用24h后，細(xì)胞活力分別為(85.19.5)%、(70.18.4)%、(34.02.8)%和(7.82

9、.9)%，明顯低于相應(yīng)濃度作用下、轉(zhuǎn)染空載體的Raji細(xì)胞活力分別為(93.58.4)%、(82.37.7)%、(64.45.8)%和(14.03.6)%（P值均0.05）。 轉(zhuǎn)染HCAP1的Raji細(xì)胞在5、10、20、40、80g/ml 5種濃度的VP16作用24h后，細(xì)胞活力分別為(73.68.2)%、(42.36.4)%、(23.83.7)%、(17.63.1)%和(10.62.2)%，明顯低于相應(yīng)濃度作用下、轉(zhuǎn)染空載體的Raji細(xì)胞活力分別為(80.79.6)%、(53.07.3)%、(35.45.0)%和(20.92.8)%（P值均0.05), 見圖1。 2.3 HCAP1在Raj

10、i細(xì)胞過表達(dá)對化療藥物IC50值的作用 轉(zhuǎn)染HCAP1基因可使Raji細(xì)胞對DNR和VP16的IC50值明顯降低，尤其對DNR的作用最為明顯，但外源HCAP1基因并未使Raji細(xì)胞對VCR的IC50值有明顯降低，見表1。 3 討論 我們的前期研究已提示單純轉(zhuǎn)染外源HCAP1 表1HCAP1在Raji細(xì)胞過表達(dá)對對Raji細(xì)胞的活力具有明顯的抑制作用4。在本實(shí)驗(yàn)中，我們分別以未與藥物作用時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對照細(xì)胞的細(xì)胞活力作為參照物，比較在不同濃度藥物作用下，轉(zhuǎn)染HCAP1的Raji細(xì)胞與對照細(xì)胞之間，細(xì)胞活力的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同濃度的DNR（0.0110.0g/ml）和VP16（580g/ml）

11、作用下，轉(zhuǎn)染HCAP1的Raji細(xì)胞，細(xì)胞活力的抑制明顯強(qiáng)于對照細(xì)胞，IC50值明顯降低。提示外源HCAP1與DNR和VP16藥物之間具有協(xié)同作用。 但我們還觀察到，在不同濃度的VCR（12.5100g/ml）作用下，轉(zhuǎn)染HCAP1的Raji細(xì)胞活力受到的抑制與對照細(xì)胞相似，IC50值亦未見明顯降低。提示外源HCAP1與VCR之間并無顯著的協(xié)同作用。 DNR、VP16和VCR均為血液腫瘤常用的化療藥物，但其藥理學(xué)作用則有所不同，DNR和VP16以細(xì)胞的DNA作為靶點(diǎn)。DNR與細(xì)胞DNA結(jié)合，插入相鄰的堿基對之間，使DNA模板發(fā)生變化；VP16則以DNA拓樸異構(gòu)酶(topoisomerase)作

12、為靶點(diǎn)，與其形成穩(wěn)定的TopDNA復(fù)合物，使DNA雙鏈處于斷裂狀態(tài)。而VCR則不以細(xì)胞的DNA為直接作用靶，而是通過干擾增殖細(xì)胞紡錘體的形成來阻止細(xì)胞分裂。HCAP1蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，具有典型的螺旋環(huán)螺旋和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。HCAP1可與其他鋅指蛋白如：NDP52（nuclear dot protein 52）、PIAS3(protein inhibitor of activated STAT3)等相互作用6。而NDP52的同源物PML蛋白的異常與急性早幼粒細(xì)胞白血病的發(fā)病緊密相關(guān)，PIAS3的作用靶STAT3的激活與多種類型白血病的發(fā)病有關(guān)。 HCAP1蛋白對腫瘤細(xì)胞惡性表型抑制的分子機(jī)制的進(jìn)

13、一步研究，可能有助于理解其與藥物協(xié)同作用的具體環(huán)節(jié)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 王俊茹，覃文新，任功一，等.肝癌相關(guān)基因HCAP1的定位克隆和初步功能研究J.腫瘤，2002，22（4）：263267.2萬大方, 蔣惠秋, 任功一,等.HC56對人肝癌細(xì)胞(SMMC7721)基因表達(dá)水平的影響J.腫瘤, 2001, 21（6）：438440.3 Wan D, He M, Wang J, et al, Two variants of the human hepatocellular carcinomaassociated HCAP1 gene and their effect on the growth of the human liver cancer cell line Hep3BJ.Genes Chromosomes Cancer, 2004,39(1): 4858.4 吳向華，王嶸，萬大方，等.HCAP1基因轉(zhuǎn)染對淋巴瘤/白血病株活力的作用J.臨床血液學(xué)雜志，2003，16（3）：125126，129.5 吳向