新型多孔自固化人工骨治療骨質(zhì)疏松骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

1、新型多孔自固化人工骨治療骨質(zhì)疏松骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究    一、研究背景人口老齡化是目前困擾全球的問題,特別在我國,隨著人口基數(shù)的增加和老齡化速度的加快,骨質(zhì)疏松患者已達(dá)到9000余萬,臨床醫(yī)生將面對大量骨質(zhì)疏松伴骨缺損的病例。在骨質(zhì)疏松環(huán)境下,破骨細(xì)胞活性增強(qiáng),骨吸收大于骨形成,新骨生成能力下降,骨缺損愈合明顯延遲,故治療較單純骨缺損更為棘手。傳統(tǒng)的自體及異體骨移植仍是首選,但各自均存在難以克服的缺點(diǎn),載體+因子的生物治療模式取得了較好療效,但載體材料有待進(jìn)一步改進(jìn)。雖然CPC攜載骨生長因子治療單純骨缺損成果顯著,但由于CPC的因子釋放能力有限,而且骨質(zhì)疏

2、松骨缺損的愈合需要較高濃度的因子水平,故其在骨質(zhì)疏松環(huán)璄下的應(yīng)用受限?？山到馕⑶驍y載因子后復(fù)合CPC,不僅使因子釋放量大大增加,而且微球可降解成孔,明顯加速材料的降解(解決CPC降解緩慢的臨床應(yīng)用障礙)。目前,主要以PLGA為材料制備微球,PLGA作為無機(jī)高分子物質(zhì),存在以下缺點(diǎn):1、緩慢的降解速率阻礙新生骨組織的長入;2、降解產(chǎn)物呈酸性,累積后可損傷周圍組織及細(xì)胞。明膠微球生物相容性好,常用作藥物載體,微球經(jīng)交聯(lián)后降解可調(diào),但常用的交聯(lián)劑如GA細(xì)胞毒性較強(qiáng),限制了明膠微球的應(yīng)用,新型生物交聯(lián)劑GP的出現(xiàn)有望解決這一問題,使明膠微球代替PLGA作為CPC的良好改性材料。二、研究目的1.以GP作

3、為交聯(lián)劑制備明膠微球,與GA交聯(lián)的微球進(jìn)行比較,探討GP交聯(lián)微球的性能優(yōu)缺點(diǎn),為多孔CPC的制備提供致孔材料。2.通過對孔徑率、生物力學(xué)強(qiáng)度及X線衍射等指標(biāo)進(jìn)行分析,確定復(fù)合型多孔CPC中明膠與骨水泥的最佳配比;并進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),綜合評估多孔CPC的生物相容性。3.明膠微球攜載rhBMP-2后復(fù)合CPC制備新型多孔人工骨,測定其體外因子緩釋曲線,通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)評估其成骨能力。4.在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型體內(nèi),采用“二維組織形態(tài)-三維CT成像-生物力學(xué)特性”的綜合手段,評估新型人工骨對促進(jìn)骨質(zhì)疏松骨缺損愈合、改善骨小梁微觀結(jié)構(gòu)及提高椎體生物力學(xué)強(qiáng)度的作用。三、研究內(nèi)容

4、和方法1.以改進(jìn)的雙相乳化冷凝聚合法制備明膠微球,分別以GP及GA進(jìn)行交聯(lián)。取60%交聯(lián)度的GP及GA明膠微球,分散于PBS中,比較其粒徑外觀、溶脹及降解性能;兩種微球分別攜載rhBMP-2,測定載藥量及包封率,觀察10天內(nèi)的藥物緩釋性能;收集GP及GA明膠微球浸提液,倍比稀釋成100%、50%及25%的濃度,分別與小鼠成骨細(xì)胞共培養(yǎng)2天,以DMEM組為空白對照,MTT法檢測細(xì)胞增殖,確定GP及GA微球的細(xì)胞毒級。2.GP交聯(lián)明膠微球以不同比例與CPC復(fù)合(0 wt%,2.5 wt%,5 wt%),制備多孔CPC,浸泡于PBS中1、3及5周后,測定材料孔徑率、抗壓強(qiáng)度及XRD情況,篩選出最佳比

5、例。消化法培養(yǎng)成骨細(xì)胞接種于常規(guī)及多孔CPC支架上,SEM觀察細(xì)胞形態(tài);不同材料浸提液(0 wt %,2.5 wt% GM/CPC及聚苯乙烯)分別與成骨細(xì)胞共培養(yǎng),鈣黃綠素-AM及碘化苯啶標(biāo)記后觀察細(xì)胞生長狀況,MTT法測定細(xì)胞增殖率,試劑盒測定ALP水平。CPC及GM/CPC分別植入山羊椎體骨缺損處,術(shù)后6周處死山羊,收集椎體標(biāo)本,部分椎體制作不脫鈣切片,麗春紅三色染色后觀察骨組織生長及材料降解情況,其余標(biāo)體脫鈣后制作石蠟切片,HE染色后觀察組織炎癥反應(yīng)、骨組織生長及材料降解情況。3.載rhBMP-2的明膠微球與CPC混合制備載因子多孔人工骨作為實(shí)驗(yàn)組(A),rhBMP-2/CPC作為對照組

6、(B)。兩者分別浸泡于5ml生理鹽水,在1、4、7、14、21、28天時(shí)收集全部浸提液,ELISA法測定rhBMP-2的濃度,計(jì)算出各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積釋藥量;兩種材料浸提液分別與成骨細(xì)胞共培養(yǎng),測定細(xì)胞增殖、ALP水平及鈣化結(jié)節(jié)情況;材料植入小鼠大腿肌袋,術(shù)后3周處死小鼠,切取材料及周圍組織,HE染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察,同時(shí)測定材料周圍組織中ALP及鈣含量。4.以卵巢切除法對15只成年山羊去勢,低鈣膳食6個(gè)月后建立骨質(zhì)疏松模型。手術(shù)去除每只動(dòng)物L(fēng)2、L4椎體部分側(cè)方骨質(zhì),造成約5 mm×10 mm×10 mm大小骨缺損,隨機(jī)選取3只山羊不作任何處理,作為空白對照組觀察骨缺損自愈

7、情況。其余動(dòng)物隨機(jī)分成兩組:實(shí)驗(yàn)組(A)植入rhBMP-2/GM/CPC;對照組(B)植入rhBMP-2/CPC。術(shù)后1周、7周及25周CT掃描后三維成像觀察骨缺損愈合情況;術(shù)后7周及25周分兩批處死動(dòng)物,采用雙能X線吸收骨密度儀測定手術(shù)椎體骨密度,組織病理學(xué)觀察骨小梁微觀結(jié)構(gòu)及材料降解成骨情況,生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)評估椎體骨質(zhì)的結(jié)構(gòu)力學(xué)強(qiáng)度。四、研究結(jié)果1. GP交聯(lián)明膠微球需3天達(dá)到穩(wěn)定的交聯(lián)度,60%交聯(lián)度的GP及GA微球在溶液中均呈規(guī)則圓形,粒徑分別為78±18m及74±10m,載藥量、包封率未見明顯差異,但GP微球分散性更佳,溶脹率(89.0±4.8%)及10天

8、內(nèi)釋藥總量(78.8±4.96%)明顯低于GA微球(118.0±7.6%、90.5±5.12%),抗降解能力(28天)強(qiáng)于GA微球(21天),100%、50%及25%濃度的GP浸提液細(xì)胞毒級均為級,而相應(yīng)GA微球的細(xì)胞毒級分別為、及級。2.GM/CPC的總孔徑率、大孔率均隨浸泡時(shí)間的延長而增加,但抗壓強(qiáng)度逐漸下降,其中2.5 wt% GM/CPC最終具有相對較高的孔徑率(65.5±1.12%)及較好的生物力學(xué)強(qiáng)度(6.3±0.6Mpa)。成骨細(xì)胞在多孔CPC支架上生長良好,細(xì)胞增殖及ALP水平均明顯高于單純CPC組,與聚苯乙烯組未見明顯差異。兩

9、組材料植入體內(nèi)3個(gè)月后,均未見不良炎癥反應(yīng),多孔CPC可見材料邊緣明膠微球降解,新生骨組織長入,有多核細(xì)胞出現(xiàn)降解材料,而單純CPC無明顯降解,材料內(nèi)部無骨組織長入。3.兩種CPC的因子緩釋曲線均由兩部分組成:1天內(nèi)的爆發(fā)式突釋及隨后的緩慢平穩(wěn)釋放;除第1天外,其余時(shí)間點(diǎn)多孔CPC的因子累積釋放量均高于單純CPC;28天后多孔CPC的累積釋藥量約為37.8±2.3%,明顯高于單純CPC的14.7±1.9%。A組成骨細(xì)胞增殖及ALP水平明顯高于B組,且細(xì)胞形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量多形狀大。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩組均可見軟骨形成,但A組軟骨量更多,材料周圍組織ALP及鈣含量測定A組也明顯高于B

10、組。4.三維CT成像顯示:空白對照組術(shù)后25周在椎體上仍可見較大骨缺損存在;A組骨缺損修復(fù)顯著快于B組,且材料降解較快,剩余材料較B組少。組織病理學(xué)結(jié)果表明:術(shù)后7周A組的平均骨礦化率高于B組,但術(shù)后25周未見明顯差異;A組的骨小梁三維結(jié)構(gòu)(平均骨小梁厚度及密度、結(jié)點(diǎn)末端比)明顯優(yōu)于B組,而平均骨小梁間距低于B組;A組材料降解較快,25周后剩余材料約為50%,且可見大量新生骨長入,B組幾乎未見明顯降解,無新生骨長入。骨密度檢測顯示術(shù)后6周兩組未見明顯差異,但25周后A組明顯高于B組。生物力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明,術(shù)后7周及25周A組分別為4.2±1.2 MPa及7.8±1.4MPa

11、,明顯高于B組的2.4±0.9 MPa及4.6±0.8MPa。五.結(jié)論1.GP交聯(lián)明膠微球所需時(shí)間稍長,60%交聯(lián)度的明膠微球降解時(shí)間約28天左右,適合作為CPC的成孔材料,而且其緩釋性能及生物相容性更佳,可廣泛應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域。2.利用明膠微球可成功制備多孔CPC,微球在2.5%比重時(shí),材料孔徑率高,強(qiáng)度較以前同等孔徑率的多孔材料有一定改善。復(fù)合材料具有極好的生物相容性,微球在體內(nèi)可緩慢降解成孔,使新生骨組織長入,從而更加速復(fù)合材料的降解,是良好的骨組織工程支架材料。3.多孔CPC復(fù)合rhBMP-2與單純r(jià)hBMP-2/CPC相比,因子的釋放能力及骨誘導(dǎo)性能均有所提高。這種新型人工骨可加速骨質(zhì)疏