菲立磁標(biāo)記的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在同種異體移植鼠肝臟中的追蹤觀察

1、菲立磁標(biāo)記的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在同種異體移植鼠肝臟中的追蹤觀察                 作者：陳小伍，方馳華，劉勝軍，崔冰，王巖，黃治榮【關(guān)鍵詞】 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；菲立磁；磁共振成像；干細(xì)胞移植【Abstract】 AIM： To study the method of tracking of allogenically grafted rat bone marrow stem cells （BMSCs） labeled wit

2、h Feridex in rat liver. METHODS：Feridex was used to label isolated BMSCs. Labeled BMSCs were examined by Prussian blue staining and electron microscopy. Successfully labeled BMSCs (2.0 mL，1×109/L) were respectively transplanted through portal vein, local liver parenchyma and caudal vein of the

3、SD rats. Six hours before transplantation and 6 h, 1, 3, and 5 weeks after transplantation, magnetic resonance imaging (MRI) examination (the sequences used were SET2WI, FSET2WI, GRET2WI) was conducted on rat livers. RESULTS： Prussian blue staining confirmed the labeling efficiency was above 90%, an

4、d transmission electron microscopy showed numerous iron particles in the cytoplasm of Feridexlabeled BMSCs. MRI (SET2WI) showed: no remarkable low signal change was found in the liver images before transplantation of all 3 groups. In the porta hepatis of portal vein transplantation group remarkable

5、low signal changes were seen 6 h after transplantation and the extent gradually expanded 1 and 3 weeks after transplantation, while the low signal change could not be seen 5 weeks after transplantation. In the section where the cells were injected in of liver topical transplantation group remarkable

6、 low signal changes were seen 6 h after transplantation and the extent gradually expanded 1, 3 and 5 weeks after transplantation. No remarkable low signal change was found in the liver images of caudal vein transplantation group at all time points after transplantation. CONCLUSION： Allogenically gra

7、fted Feridexlabeled BMSCs can be tracked effectively （菲立磁標(biāo)記的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在同種異體移植鼠肝臟中的追蹤觀察 in rat liver by MRI.【Keywords】 bone marrow stem cells；Feridex；magnetic resonance imaging；stem cell transplantation【摘要】 目的：研究菲立磁標(biāo)記的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在同種異體移植鼠肝臟中的追蹤方法. 方法： 采用菲立磁（Feridex）對(duì)分離培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行標(biāo)記，Prussian blue染色和

8、電鏡觀察對(duì)標(biāo)記后的BMSCs進(jìn)行鑒定；取鑒定后的BMSCs 2 mL（1×109/L）分別注射到SD異體大鼠的門靜脈、肝局部實(shí)質(zhì)、尾靜脈內(nèi)；采用磁共振成像(MRI)技術(shù)（SET2WI，F(xiàn)SET2WI，GRET2WI序列）分別對(duì)移植前6 h,移植后6 h，1，3和5 wk時(shí)的大鼠肝臟進(jìn)行掃描. 結(jié)果：Prussian blue染色證實(shí)Feridex標(biāo)記BMSCs陽性率>90，透射電鏡見鐵顆粒位于BMSCs胞質(zhì)中；MRI掃描 SET2WI序列成像顯示：各移植組在移植前肝臟均未見異常低信號(hào)區(qū)；門靜脈組大鼠移植后6 h在肝門部可見異常的低信號(hào)改變，1，3 wk低信號(hào)改變范圍逐漸擴(kuò)大，第

9、5周時(shí)低信號(hào)改變消失；肝內(nèi)注射組大鼠移植后6 h在肝臟局部注入?yún)^(qū)域可見異常的低信號(hào)改變，1，3，5 wk低信號(hào)改變區(qū)域逐漸擴(kuò)大. 尾靜脈組在移植后各時(shí)間點(diǎn)均未見到異常低信號(hào)改變. 結(jié)論：Feridex標(biāo)記的大鼠BMSCs在同種異體移植鼠肝臟中可用MRI進(jìn)行有效的追蹤.【關(guān)鍵詞】 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；菲立磁；磁共振成像；干細(xì)胞移植0引言國(guó)內(nèi)外研究1-2表明，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）在一定的條件下，可分化為有功能的肝細(xì)胞，且獲取及體外培養(yǎng)容易，沒有倫理道德的爭(zhēng)議，可以作為種子細(xì)胞來治療急慢性肝功能衰竭和修復(fù)肝臟損傷，具有極大的研究?jī)r(jià)值. 但同種異體移植

10、后BMSCs在活體肝內(nèi)的定居、遷移和分化機(jī)制尚不清楚. 我們利用直徑為納米級(jí)別的超順磁性氧化鐵粒子菲立磁（feridex）對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行標(biāo)記，并利用磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技術(shù)對(duì)多種途徑同種異體移植的BMSCs在大鼠肝內(nèi)進(jìn)行了定位與追蹤.1材料和方法1.1材料SD清潔級(jí)大鼠（80100 g，2只，供提取骨髓用；200220 g，雄性36只，供同種異體細(xì)胞移植用）購(gòu)自廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室. Feridex購(gòu)自美國(guó)泛華醫(yī)藥公司. DMEM（低糖）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清購(gòu)自?shī)W地利PAA公司；胰蛋白酶購(gòu)自AMERSCO

11、公司；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純. Olympus相差顯微鏡，HERAEUS超凈臺(tái)，F(xiàn)ORUM CO2培養(yǎng)箱，東芝1.5T超導(dǎo)MRI機(jī)（型號(hào)Exelart/P3）.1.2方法1.2.1BMSCs分離、培養(yǎng)、鑒定及傳代percoll梯度離心法(連續(xù)密度梯度離心分離法)分離純化大鼠BMSCs. 采用密度為1.073 kg/L的Percoll液分離骨髓液，離心后BMSCs將聚積在第二層. 完整取大鼠雙后肢股骨，DHanks液吹吸骨髓. 抗凝骨髓經(jīng)低糖的DMEM培養(yǎng)基稀釋. 將比重為1.073 kg/L的Percoll置試管底部，按照11的比例緩慢滴加稀釋后的骨髓，900 g/min離心30 min.

12、收獲分離的單個(gè)核細(xì)胞，DMEM洗兩次，接種于24孔板內(nèi)，各孔內(nèi)加入100 mL/L胎牛血清，48 h后除去非貼壁細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)液，50 mL/L CO2，37和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底90%融合時(shí)，2.5 g/L胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng). 收集第4代BMSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29，CD44，CD45等表面標(biāo)志、成骨誘導(dǎo)后行細(xì)胞堿性磷酸酶染色. 具'' >菲立磁標(biāo)記的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在同種異體移植鼠肝臟中的追蹤觀察(2) 體方法參照文獻(xiàn)3.1.2.2Feridex標(biāo)記BMSCs的制備取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSCs，消化后機(jī)械吹打成單細(xì)胞，以約5

13、5;108/L的密度接種到含有不同濃度Feridex的200 mL/L胎牛血清培養(yǎng)基(低糖DMEM)中孵育. 標(biāo)記培養(yǎng)基中Fe3+濃度為16.8 mg/L. 50 mL/L CO2，37培養(yǎng)48 h. 2.5 g/L胰蛋白酶消化，PBS重懸，計(jì)數(shù)后備用. Prussian blue染色及透射電鏡鑒定鐵顆粒是否被吞噬進(jìn)細(xì)胞.1.2.3Feridex標(biāo)記BMSCs大鼠同種異體移植及MRI追蹤細(xì)胞移植：36只SD大鼠同室同條件飼養(yǎng). 設(shè)門靜脈組、肝內(nèi)注射組、尾靜脈組，每組6只，并每組設(shè)6只為對(duì)照. 經(jīng)10 mg/L水合氯醛（1 mg/kg體質(zhì)量）腹腔麻醉后固定，門靜脈組、肝內(nèi)組：消毒腹部皮膚，分層進(jìn)

14、入腹腔，暴露肝臟，顯露肝門部，解剖門靜脈. 門靜脈注射組用微量注射器在15 min內(nèi)向門靜脈緩慢注入細(xì)胞懸液2 mL（含BMSCs 1.0×109/L），留針10 min，拔針后局部按壓止血；肝內(nèi)注射組直接向肝尾狀葉下半部?jī)?nèi)注入同等劑量的細(xì)胞懸液2 mL，方法同上. 見無明顯滲血后，300 mg/L雙氧水沖洗術(shù)區(qū)；逐層關(guān)閉腹腔，碘伏消毒皮膚切口. 術(shù)后給予慶大霉素1×104 U，1次/d腹腔注射，持續(xù)7 d，單籠飼養(yǎng). 尾靜脈組：穿刺前先將尾部放在4550溫水中浸潤(rùn)0.5 min,乙醇擦拭，小針穿刺，見回血后，在15 min內(nèi)緩慢注入標(biāo)記后的BMSCs懸液2 mL（含BMS

15、Cs 1.0×109/L或2.0×109/L或3.0×109/L），對(duì)照大鼠注入未標(biāo)記的BMSCs懸液2 mL. 留針10 min，拔針后局部按壓止血.1.2.4MRI檢查所使用的MRI機(jī)為1.5T場(chǎng)強(qiáng). 為保證大鼠肝臟信號(hào)有效顯示，采用小型相控陣線圈采集和接受信號(hào)（本實(shí)驗(yàn)使用膝關(guān)節(jié)線圈檢查）,并在每次掃描前進(jìn)行勻場(chǎng). 檢查時(shí)同前方法麻醉后俯臥位固定于有機(jī)玻璃板上，并置于線圈中央. 掃描序列為SE T2WI, FSET2WI, GRET2WI，并對(duì)圖像的清晰度、對(duì)比度、解剖形態(tài)等各方面進(jìn)行綜合對(duì)比，以選定最佳的成像序列進(jìn)行掃描分析. 掃描主要參數(shù)為：TR=4900

16、 ms，TE=100 ms，翻轉(zhuǎn)角為90/160，2次采集，層厚3 mm. 掃描前采用三軸定位圖預(yù)設(shè)掃描視野（FOV      ），以適應(yīng)大鼠的體型，保證有較好的信噪比. 分別于移植術(shù)前6 h、移植術(shù)后6 h，1，3和5 wk對(duì)大鼠肝臟行MRI檢查.1.2.5組織學(xué)檢查MRI檢查后解剖大鼠肝臟，觀察肝臟組織，并取肝組織（肝內(nèi)組取肝尾狀葉下半部、門靜脈組和尾靜脈組取肝門部及各肝葉部位）行4 m冰凍連續(xù)冠狀切片，最后行Prussian blue染色和核固紅復(fù)染.2結(jié)果2.1BMSCs培養(yǎng)與鑒定原代細(xì)胞接種后24 h內(nèi)，單個(gè)核細(xì)胞貼壁，48 h可見部分貼壁細(xì)胞

17、開始分裂增生，細(xì)胞形態(tài)為多角形、梭形或紡錘形. 未貼壁細(xì)胞隨換液而逐步消除. 1 wk后貼壁細(xì)胞體積增大，有長(zhǎng)桿狀、三角形、多邊形細(xì)胞等. 形成多個(gè)細(xì)胞集落，大小不一，呈旋渦狀. 原代細(xì)胞生長(zhǎng)至90左右時(shí)傳代. 傳代后細(xì)胞增長(zhǎng)速度加快，平均5 d左右傳代. 第3代第5代細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好. 第6代開始細(xì)胞增長(zhǎng)速度變慢，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)亦變差. 第3代BMSCs行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果：CD29+/CD44+/CD45-，且細(xì)胞純度較高. 成骨誘導(dǎo)2 wk后細(xì)胞堿性磷酸酶染色呈強(qiáng)陽性.2.2Feridex標(biāo)記BMSCs的Prussian blue染色細(xì)胞貼壁良好，Prussian blue染色見90以上

18、BMSCs胞質(zhì)內(nèi)含有藍(lán)色提菲立磁標(biāo)記的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在同種異體移植鼠肝臟中的追蹤觀察(3) 顆粒，即鐵顆粒(圖1).2.3標(biāo)記后BMSCs的透射電鏡觀察可見鐵顆粒位于BMSCs胞質(zhì)中(圖2).2.4BMSCs移植前后MRI掃描經(jīng)過對(duì)三種T2WI序列肝臟掃描圖像的對(duì)比分析，以SET2WI序列成像最佳，因此采用SET2WI序列對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行MRI掃描并進(jìn)行圖像分析. 各移植組在移植術(shù)前肝臟實(shí)質(zhì)均未見異常低信號(hào)區(qū)，可以清晰顯示正常門靜脈樹的流空信號(hào)影（低至無信號(hào)區(qū)）以及正常膽道樹高信號(hào)影. 移植后大鼠肝臟掃描：門靜脈組：移植后6 h在肝門部可見異常的低信號(hào)改變，移植后1，3 wk低信號(hào)改變范圍逐

19、漸擴(kuò)大，移植后第5周時(shí)低信號(hào)改變未能發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組肝臟在各時(shí)間點(diǎn)均未見異常低信號(hào)改變； 肝內(nèi)組：移植后6 h在局部注入?yún)^(qū)域可見異常的低信號(hào)改變，移植術(shù)后1，3和5 wk低信號(hào)改變區(qū)域逐漸擴(kuò)大，對(duì)照組肝臟未見異常低信號(hào)改變；尾靜脈組：移植標(biāo)記后的BMSCs懸液濃度為 1.0×109/L時(shí)，大鼠肝臟與對(duì)照組比較未見異常低信號(hào)改變. 調(diào)整標(biāo)記后的BMSCs懸液濃度為2.0×109/L及3.0×109/L后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)比較肝臟仍未能見到異常低信號(hào)改變.2.5組織學(xué)檢查門靜脈組：實(shí)驗(yàn)組移植后肝門部可見聚積的呈藍(lán)色染色的鐵顆粒細(xì)胞，各時(shí)間點(diǎn)組織學(xué)改變基本與MRI影

20、像對(duì)應(yīng)（圖3）. 對(duì)照組未見藍(lán)色染色的鐵顆粒細(xì)胞. 肝內(nèi)組：實(shí)驗(yàn)組移植后肝尾狀葉下半部切片可見許多細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色染色的鐵顆粒細(xì)胞，各時(shí)間點(diǎn)組織學(xué)改變基本與MRI影像對(duì)應(yīng)（圖4）. 對(duì)照組未見藍(lán)色染色的鐵顆粒細(xì)胞. 尾靜脈組：實(shí)驗(yàn)組移植后各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較，肝內(nèi)可見少量分散的呈藍(lán)色染色的鐵顆粒細(xì)胞. 對(duì)照組未見藍(lán)色染色的鐵顆粒細(xì)胞.3討論目前廣泛應(yīng)用的幾種細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)，如BrdU法4,DAPI法5, PKH26法6,GFP法7,Y染色體標(biāo)記法8等，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，但均需行組織切片，對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象有創(chuàng)傷性，多需處死實(shí)驗(yàn)對(duì)象. 這些方法既不利于在同一個(gè)體內(nèi)連續(xù)、動(dòng)態(tài)的跟蹤觀察，也不可能應(yīng)用于人體. Fer

21、idex可以在體外標(biāo)記細(xì)胞并利用MRI技術(shù)在活體動(dòng)態(tài)、無創(chuàng)地追蹤移植的細(xì)胞. 它是一種超順磁性納米顆粒，利用其磁順應(yīng)性，可以在外加磁場(chǎng)的作用下引起足夠強(qiáng)度的MRI信號(hào)的改變而追蹤被標(biāo)記物在活體內(nèi)的遷徙、分化等. 它可通過非特異性膜表面吸收過程進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，包括人類的神經(jīng)干細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞等，在合適的濃度標(biāo)記時(shí)被標(biāo)記細(xì)胞的增殖、分化能力不受影響. 國(guó)內(nèi)外眾多科學(xué)家9-12已應(yīng)用此方法標(biāo)記細(xì)胞同種異體移植入腦內(nèi)的定位、追蹤等. 至于利用MRI追蹤同種異體移植鼠肝臟中的Feridex標(biāo)記的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，目前未見報(bào)道. 我們對(duì)此進(jìn)行了初步研究，觀察了多種途徑同種異體移植的Feridex標(biāo)記細(xì)胞在肝

22、內(nèi)的定位和隨時(shí)間的變化情況，以期為此標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于肝臟疾病的治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).本實(shí)驗(yàn)我們采用SET2WI序列對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行MRI掃描并進(jìn)行圖像分析. 由于Feridex是一種含鐵的MRI造影劑，能夠影響其周圍的微磁場(chǎng)環(huán)境，造成對(duì)局部微磁場(chǎng)環(huán)境十分敏感的T2時(shí)間縮短，采集時(shí)局部呈異常低信號(hào)改變，所以SET2WI序列也是MRI有效的觀察Feridex在局部組織內(nèi)濃聚的序列. 各移植組在移植術(shù)前肝臟均未見異常低信號(hào)區(qū). 移植后大鼠肝臟掃描，門靜脈組結(jié)果提示門靜脈移植的細(xì)胞可透過血管壁進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)，隨著時(shí)間的增加，磁性粒子分散，到第5周時(shí)密度不足以引起足夠的MRI影像改變而不能繼續(xù)追蹤. 肝內(nèi)組MR

23、I結(jié)果考慮局部注射的BMSCs可隨時(shí)間的改變而增殖或遷移. 尾靜脈組雖加大移植細(xì)胞濃度和數(shù)量，實(shí)驗(yàn)組大鼠與對(duì)照組比較肝臟仍未能發(fā)現(xiàn)異常低信號(hào)改變. 肝組織切片見少量分散的呈藍(lán)色染色的鐵顆粒細(xì)胞，考慮經(jīng)外周靜脈移植細(xì)胞入血后被大量破壞或分散到其它組織器官，進(jìn)入肝臟的細(xì)胞亦分散至肝臟各葉，不能產(chǎn)生足夠的磁順應(yīng)性 ) 而引起MRI圖像的改變.綜合分析3種途徑移植的BMSCs的MRI追蹤結(jié)果，可得出以下初步結(jié)論： 移植細(xì)胞達(dá)到一定的量方能引起有效的MRI影像改變. 外周靜脈移植未能見到異常的肝臟MRI低密度影改變，考慮為進(jìn)入肝臟的細(xì)胞（或Fe3+）密度不夠. 另外，門脈移植后6 h，1 wk，3 wk

24、時(shí)可見到異常低密度影像改變，到5 wk時(shí)未能繼續(xù)見到，考慮隨著移植細(xì)胞的增殖、分裂或遷移導(dǎo)致Fe3+密度降低所致. 移植途徑影響追蹤效果：外周靜脈移植的BMSCs雖提高移植細(xì)胞濃度仍未能有效追蹤；門靜脈移植的細(xì)胞移植后3 wk內(nèi)可見到影像改變，但5 wk后未能繼續(xù)追蹤；肝內(nèi)直接注射移植的細(xì)胞在移植5 wk后仍可繼續(xù)追蹤. 提示肝內(nèi)直接注射因細(xì)胞無需透過血管壁（門靜脈途徑）或在外周血管長(zhǎng)途遷徙受到損害（尾靜脈途徑）而最為有效，這為移植途徑的選擇提供了參考. Feridex標(biāo)記的大鼠BMSCs在同種異體移植鼠肝臟中的MRI追蹤存在的問題：MRI影像的判斷：相對(duì)于腦實(shí)質(zhì)而言，肝臟肝門部血管粗大，膽管

25、分布復(fù)雜，且毗鄰胃腸道等空腔臟器. 血管流空、空氣的低密度影像干擾對(duì)標(biāo)記細(xì)胞的圖像會(huì)產(chǎn)生較大的干擾. 目前對(duì)Feridex標(biāo)記BMSCs門靜脈或肝臟局部移植的MRI影像判斷還主要依靠同一肝臟移植前后同一層面影像的對(duì)比，并需高年資MRI醫(yī)師的協(xié)助. 如何降低移植細(xì)胞影像的判斷難度、減少血管流空、空腔臟器影像的干擾，還需在進(jìn)一步的移植實(shí)驗(yàn)中摸索. 小的低密度影像改變的追蹤：目前MRI儀的掃描厚度較大，容易遺漏較小的影像變化，相信隨著MRI技術(shù)的進(jìn)步，有望追蹤到移植細(xì)胞更小的影像變化. Fe3+對(duì)肝細(xì)胞的毒性：引起足夠的MRI影像改變需足夠的Fe3+濃度，但高濃度的Fe3+對(duì)細(xì)胞是有害的. 雖部分研

26、究者9-10認(rèn)為目前細(xì)胞標(biāo)記所應(yīng)用的Fe3+濃度不足以對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生影響，我們也未觀察到標(biāo)記細(xì)胞周圍正常肝細(xì)胞有明顯的毒性反應(yīng)，但此影響仍有待于進(jìn)一步觀察和研究.【參考文獻(xiàn)】1 張剛慶，方馳華，池達(dá)智. 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究J. 中華外科雜志, 2005，43(11):716-720.2 Inderbitzin D, Avital I, Gloor B, et al. Functional comparison of bone marrowderived liver stem cells: Selection strategy for cellbased t

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