糞便基因組DNA提取方法比較及在沙門(mén)菌定量PCR檢測(cè)中的應(yīng)用

1、 實(shí)驗(yàn)研究糞便基因組DNA 提取方法比較及在沙門(mén)菌定量PCR 檢測(cè)中的應(yīng)用3岳昌武, 呂玉紅, 劉坤祥, 陳公安(遵義醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室, 貴州563003摘要:目的建立并優(yōu)化1種可用于臨床微生物檢測(cè)的糞便微生物基因組DNA 提取方法并應(yīng)用于沙門(mén)菌定量PCR 快速檢測(cè)。方法分別利用土壤微生物基因組DNA 提取試劑盒法、微生物基因組DNA 提取試劑盒法和本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)酚/氯仿抽提法提取腹瀉患者糞便基因組DNA , 根據(jù)沙門(mén)氏菌16srDNA 、d T 等基因或DNA 功能區(qū)序列設(shè)計(jì)PCR 引物, 進(jìn)行多基因定量PCR 檢測(cè)。結(jié)果3種方法提取的基因組DNA 均可進(jìn)行有效的定量PCR 擴(kuò)增, 采用所建立

2、的多重PCR 方法可特異鑒別糞便沙門(mén)氏菌。結(jié)論本研究改進(jìn)的糞便基因組DNA 提取方法及臨床微生物的定量PCR 檢測(cè)可在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)大量臨床樣品快速診斷, 有一定應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞:基因組DNA 提取; 糞便; 定量PCR ; 沙門(mén)菌中圖分類(lèi)號(hào):R378.22;R446. 13文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):167128348(2009 2423157203Comp arison of three protocols for extraction of total fecal DNA and identif ication of S almonella with real time PCRYU E

3、Chang 2w u , L U Yu 2hong , L IU Kun 2x iang , et al.(Cent ral L ab of Zunyi Medical College , Zuny i , Guiz hou 563003, China Abstract :ObjectiveTo investigate the effects of different fecal DNA extraction methods on the analysis of the diver 2sity of getting diarrhea. Methods Three protocols were

4、used to extract total rom an with diarrhea. The products of DNA were evaluated by agarose gel electrophoresis and of d T fermentation of the three DNA isolation protocols were compared. R esults were all amplified by the primer of S rRNA gene and d T fermentation DNA isolation methods have different

5、 effects on the amplification of DNA DNA extraction from fecal samples ,the SY BR Green real 2time PCR could in fecal samples for Salmonell.K ey w ords :;fecal ;real time PCR ;Salmonella目前沙門(mén)菌的檢測(cè)方法仍為依靠生化反應(yīng)和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。近年來(lái), 分子生物學(xué)技術(shù)中的定量PCR 技術(shù)以其敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速、可以定量等優(yōu)點(diǎn)被越來(lái)越多地應(yīng)用于糞便微生物檢驗(yàn), 但在人類(lèi)腸道的微生物群落組成非常復(fù)雜, 菌群與宿主的健康

6、和疾病有密切的關(guān)系, 糞便中微生物生態(tài)分布是臨床腸道疾病診斷的重要依據(jù)1。由于目前很多腸道微生物的生長(zhǎng)條件尚不明了, 導(dǎo)致不可或很難培養(yǎng), 加之純培養(yǎng)還要考慮到微生物對(duì)培養(yǎng)基的選擇性、嚴(yán)格的厭氧條件等等, 在培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)成本上消耗較大, 不僅增加了患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān), 還可能延誤疾病治療時(shí)機(jī), 甚至誤診。因此希望能夠直接提取糞便中腸道微生物的DNA 進(jìn)行系列的分子生物學(xué)研究, 分析其微生態(tài)組成, 為臨床疾病診斷提供科學(xué)依據(jù)。由于糞便中所含雜質(zhì)太多, 不僅含有動(dòng)物腸道脫落細(xì)胞, 而且含有腸道微生物、未消化的食物、消化酶、黏液、膽堿、膽紅素、植物多糖等, 這些雜質(zhì)不但易導(dǎo)致目標(biāo)DNA 的降解, 還對(duì)P

7、CR 反應(yīng)有強(qiáng)烈的抑制作用225。因此, 優(yōu)化建立1種快速、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA 提取方法勢(shì)在必行。本文比較了不同類(lèi)型的糞便微生物提取方法, 并利用DNA 提取物進(jìn)行了針對(duì)沙門(mén)菌屬保守基因16srDNA 及d T 等基因或DNA 功能區(qū)序列設(shè)計(jì)定量PCR 引物, 優(yōu)化了定量PCR 檢測(cè)條件, 建立了檢測(cè)沙門(mén)菌屬的定量PCR 檢測(cè)方法, 并進(jìn)行了臨床病例沙門(mén)菌PCR 檢測(cè)方法的應(yīng)用性研究。1材料與方法1. 1材料1. 1. 1菌株都伯林沙門(mén)菌(臨床分離株 由遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室提供。1. 1. 2試劑與儀器土壤基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自歐米伽公司(Omiga ,USA , 微生

8、物基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司(北京 、DNA Maker 等試劑購(gòu)自北京賽百盛公司, 引物由北京賽百盛公司合成, 定量PCR 試劑盒SY BR TMPremix Ex TaqTM 購(gòu)自寶生物公司(大連 , 其他生化試劑均購(gòu)自上海生工公司。細(xì)菌裂解液(150mmol/L NaCl ,100mmol/L ED TA , p H8. 0 、細(xì)菌裂解液(100mmol/L NaCl ,0. 5mol/L Tris 2HCl p H8. 0 及細(xì)菌裂解液(0. 2mol/L NaO H ,0. 1%SDS 。Icycler IQ 型定量PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自百樂(lè)公司(Bio 2Rad , US

9、A , 紫外分光光度計(jì)為貝克曼DU800型(Beckman ,USA , GEN ETOOL S 凝膠圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自基因公司(G ene ,USA , Eppendorf 5406型冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppen 2dorf (USA 。1. 1. 3引物合成根據(jù)參考文獻(xiàn)628, 結(jié)合Genbank 公布沙門(mén)氏菌16srDNA 、d T 等基因或DNA 功能區(qū)序列設(shè)計(jì)合成下75133基金項(xiàng)目:貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(gzwkj2008212037 。 列引物。16srDNA (沙門(mén)氏菌通用 為16s rDNA R (下游引物 :52CCG T GC T TC A GT TCC A G T

10、 GT G 23,16srDNA F(上游引物 :52GT G GCG GAC GGG T GA GTA A 23, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度231bp 。d T 擴(kuò)增引物(沙門(mén)氏菌通用 為d T F(上游引物 :52GTA A GG GTA A T G GGT TCC 23; d T R (下游引物 :52CACA T TA T TCGCTCAA T GGA G 23,PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為289bp 。1. 1. 4臨床標(biāo)本收集2008年11月至2009年3月就診的臨床腹瀉病例39例, 其中經(jīng)臨床確診曲都柏林沙門(mén)菌感染6例, 以保存的此6例患者腹瀉物為原料。1. 2方法1. 2. 1標(biāo)準(zhǔn)菌株準(zhǔn)備

11、及細(xì)菌總DNA 提取將菌種在麥康凱平板上劃線,37培養(yǎng)16h , 挑取典型單個(gè)菌落接種于LB 肉湯中,37過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。取過(guò)夜振蕩培養(yǎng)的菌懸液1mL , 以上述天根公司細(xì)菌基因組提取試劑盒法提取總DNA (按DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所制備DNA 的260nm 吸光值, 計(jì)算OD260/OD80, 預(yù)測(cè)DNA 純度及含量, 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后, 置于-80冰箱長(zhǎng)期保存。1. 2. 2糞便標(biāo)本基因組DNA 提取分別取5g 糞便于50mL離心管中, 以40mL PBS 懸浮, 渦旋震蕩10min 。500r/min 離心5min 。小心吸取上層渾濁液體, 轉(zhuǎn)移到新的5

12、0mL 離心管中,5000r/min 離心10min , 棄上清液, 分別取1g 沉淀(濕菌 分別加入0. 1g 玻璃珠(直徑0. 5mm , 以下述3DNA 。本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)酚/氯仿抽提法(方法1 :1g沉淀(濕菌 于15mL 離心管中, , 5min , 加入1mL , 1mL 顛倒混勻10次, /(25241 , 輕柔顛倒混勻10次, 70,10min ,11000r/min , 室溫離心5min 。小心轉(zhuǎn)移上清液至另一新15mL 離心管中, 加入2倍體積無(wú)水乙醇, -20放置10min , 11000r/min , 4, 離心10min , 沉淀以75%乙醇5mL 洗2次, 自然風(fēng)干,

13、加入50LTE (或dd H 2O 溶解沉淀, 將溶液小心轉(zhuǎn)移至DNA 凝膠回收試劑盒所附DNA 結(jié)合柱中心, 靜止5min ,10000r/min 離心2min , 所得溶液即為糞便樣品基因組DNA 。微生物基因組DNA 提取試劑盒法(方法2 和土壤微生物基因組DNA 提取試劑盒法(方法3 分別按其試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將上述3種方法分別提取的DNA 以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)260nm 吸光值, 計(jì)算OD260/OD80, 計(jì)算DNA 純度及含量,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后, 置于-80冰箱長(zhǎng)期保存。1. 2. 3PCR 擴(kuò)增9取DNA 模板1L (50ng/L , SY BR TM Premix E

14、x Taq TM 10L , 引物(10mol/L 各1L 、總反應(yīng)體積為20L 。95預(yù)變性3min ; 95變性5s , 60退火加延伸20s , 共45循環(huán); 最后72延伸2min 。在每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的溫度段結(jié)束后檢測(cè)熒光強(qiáng)度; 最后進(jìn)行熔解曲線監(jiān)測(cè), 即完成上述最后一個(gè)循環(huán)后, 溫度升至95, 立即降溫至55, 保溫45s 后以0. 2/s 的升溫速率逐漸升至95, 在此升溫過(guò)程中進(jìn)行熒光強(qiáng)度的連續(xù)檢測(cè)退火溫度。反應(yīng)完畢后擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步鑒定。1. 2. 4特異性檢測(cè)按同樣的定量PCR 反應(yīng)條件, 對(duì)經(jīng)傳統(tǒng)方法驗(yàn)證的曲都柏林沙門(mén)菌進(jìn)行定量PCR 特異性檢測(cè)。利用實(shí)驗(yàn)室

15、保存的非沙門(mén)菌株進(jìn)行PCR 特異性驗(yàn)證。2結(jié)果2. 1不同方法提取基因組DNA 質(zhì)量比較分光光度法測(cè)定A60/A280比值在1. 62. 0之間。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示, 3種方法均能有效獲得糞便微生物基因組DNA , 根據(jù)與DNA maker 比較(以灰度值為判定標(biāo)準(zhǔn) , 同樣樣品量的條件下, DNA 產(chǎn)量由高至低依次為方法3、方法1、方法2, 然而方法1和方法2提取總DNA 中均有較多RNA 殘留。樣品DNA 條帶清晰、整齊。與方法2和方法3相比, 方法1提取的總DNA 在電泳圖中主條帶后方尚出現(xiàn)第二個(gè)模糊條帶, 可能是腸道脫落細(xì)胞DNA (圖1 。2. 2定量PCR 檢測(cè)沙門(mén)菌的特異性定

16、量PCR 擴(kuò)增結(jié)果表明,3種不同方法提取的總DNA 都可以有效的進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增,16SrDNA 出現(xiàn)的CT 值較小,d T 出現(xiàn)的CT 值較大, 提示基因組中16SrDNA 拷貝數(shù)大于d T 拷貝數(shù)(圖2C 。從擴(kuò)增熔解曲線可以看出, 呈現(xiàn)出典型的熔解峰, 擴(kuò)增目標(biāo)基因的熔點(diǎn)值Tm 為85(16SrDNA 和87(d T fermentation , 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(圖2A 、B 。與陽(yáng)性對(duì)照曲都柏林沙門(mén)菌所顯示結(jié)果完全一致, 陰性對(duì)照大腸桿菌結(jié)果為陰性。陰性對(duì)照水也未出現(xiàn)特異性熔解峰, 。以上結(jié)果表明:本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的合于SY 實(shí)時(shí)PCR 擴(kuò)增的T M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)250bp DNA

17、 lader ;1:方法1;2:方法2;3:方法3。圖13種不同方法提取的糞便基因組DNA 質(zhì)量比較A :16srDNA 的PCR 融解曲線; B :d T 的PCR 融解曲線; C :16srDNA 和d T 的PCR 擴(kuò)增曲線(1為16srDNA ,2為d T ,3為負(fù)對(duì)照 。圖2糞便總DNA 定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果8513 3討論由于糞便中所含雜質(zhì)太多, 不僅含有動(dòng)物腸道脫落細(xì)胞, 而且含有腸道微生物、未消化的食物、消化酶、黏液、膽堿、膽紅素、植物多糖等, 這些雜質(zhì)易導(dǎo)致目標(biāo)DNA 的降解。因此, 在動(dòng)物糞便DNA 提取技術(shù)中, 如何保證產(chǎn)物的純度和濃度, 是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。目前, 各種糞

18、便DNA 提取方法都圍繞怎樣除去這些雜質(zhì)而得到高純度且足夠的目的基因組而展開(kāi)。但是, 在糞便DNA 提取過(guò)程中, 隨著純化次數(shù)和純化步驟的增加, 難以避免的造成DNA 量上的損失9。本研究比較了目前評(píng)價(jià)較好歐米伽土壤總DNA 提取試劑盒、天根微生物DNA 提取試劑盒和本實(shí)驗(yàn)室改良的酚/氯仿法提取總DNA 等3種方法, 并用臨床確診病例進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增沙門(mén)菌特異基因16srDNA 、d T 等PCR 引物進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證, 39例腹瀉病例中經(jīng)臨床確診為曲都柏林沙門(mén)菌感染6例均能通過(guò)PCR 擴(kuò)增出上述2個(gè)基因的相應(yīng)片段, 符合率為100%, 方法3效果最好, 同時(shí)天根試劑盒法和作者建立的方法提取總

19、DNA 進(jìn)行的擴(kuò)增, 各有1個(gè)病例未能有效擴(kuò)增出16srDNA 相應(yīng)片段, 但d T 相應(yīng)片段均能得到有效擴(kuò)增。這可能是歐米伽試劑盒在裂菌提取總DNA 后, 增加相應(yīng)的試劑和處理步驟, 大大的降低了提取物中可能會(huì)抑制PCR 等分子生物學(xué)操作的作用效果。這種現(xiàn)象還提示作者, 在以糞便等復(fù)雜原料進(jìn)行核酸提取及后續(xù)的分子生物學(xué)操作中, 靶基因不同, 其作用效果也可能不一樣, 具體到臨床PCR 或酶切等分子診斷時(shí), 以大大降低誤診的風(fēng)險(xiǎn), 提高檢出效率, 當(dāng)?shù)南♂屗肈NA 濃度, 的檢出效果, 也就是說(shuō), , 可以考慮將所得PCR 擴(kuò)增, 可。(致謝:本研究受貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金(gzwkj20

20、08210237 資助, 標(biāo)本采集得到遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物檢驗(yàn)室陳澤慧副教授大力協(xié)助, 特此一并致謝! 參考文獻(xiàn)1趙健元, 李進(jìn)華. 一種高效的哺乳動(dòng)物糞便DNA 提取通用方法J.激光生物學(xué)報(bào),2008,17(5 :696.2鐘華, 賴(lài)旭龍, 魏榮平, 等. 一種從大熊貓糞便中提取DNA 的改進(jìn)方法J.動(dòng)物學(xué)報(bào),2003,49:670.3李萬(wàn)水, 陳松, 涂政. 糞便DNA 提取及檢驗(yàn)J.中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2004,19(4 :219.4楊德君, 吳襟, 劉毅, 等. 一種快速提取腸道微生物總DNA 的方法J.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2006,18(2 :91.5李業(yè)鵬, 鐘凱, 楊寶蘭,

21、等. 食品中沙門(mén)菌PCR 檢測(cè)方法的建立J.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2006,18(1 :17.6王耀, 鄭秋月, 曹際娟. SY BR Green 實(shí)時(shí)PCR 快速檢測(cè)沙門(mén)菌J.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2006,18(4 :314.7K obayashi H , Hall GS , Tuohy MJ , et al. Bilateral periprosthetic joint infection caused by Salmonella en 2terica serotype Enteritidis , and identification of Salmo 2nella sp using molecular techniquesJ.Int J Infect Dis , 2009,6:562.8D Urso , S ,et al.