骨髓間充質(zhì)干細胞和軟骨細胞共培養(yǎng)復(fù)合同種異體脫鈣骨基質(zhì)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨全層缺損

1、作者：馮萬文，夏亞一，孫正義，吳萌，王翠芳，黨躍修【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細胞；軟骨細胞；共同培養(yǎng)技術(shù)；脫鈣骨基質(zhì)；關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)Fullthickness articular cartilage defect repairment by coculture of autogenic bone marrowderived mesenchymal stem cells with chondrocytes and implantation into allogenic demineralized bone matrix in rabbits【Abstract】 AIM: To investigate

2、the feasibility of articular cartilage defect repairmentby coculture of autogenic bone marrowderived mesenchymal stem cells(BMSCs) with chondrocytetes and implantation into allogenic demineralized bone matrix(DBM), evaluate the outcomes of repairmentin order to provide a theoretical basis for optimi

3、zing cell resources for seeding. METHODS: Twopassaged BMSCs and chondrocytes were collected both at a concentration of 5109/L and then cocultured at 21. Articular cartilage defects in the knee joints of rabbits repaired by the cocultured cells seeded into allogenic DBM served as experimental group A

4、, by simple DBM as control group B and by nothing as control group C. Repaired tissues were evaluated with macroscopic observation,histological scores and immunohistochemical staining at week 8 and 16 after transplantation. RESULTS: Chondrocytes cocultured became rich in extracellular matrix and pro

5、liferated promptly. The ratio of chondrocytes to BMSCs achieved above 11 at 5-7 d after coculture.In the experimental group A repaired tissues represented hyaline,smooth and flat.Chondrocytes in the zones of integrating with peripheral native cartilages were more mature. In the control group B and C

6、, repaired tissues were fibers.Histological scores indicated that experimental group A excelled group B and C, and the differences were statistically significant(P0.05). Immunohistochemical staining showed that cells in the zones of repaired tissues were larger in size, arranged columnnedly, rich in

7、 typecollagen matrix and integrated satisfactorily with native adjacent cartilages and subchondral bones in the experimental group A at week 16 postoperatively. CONCLUSION: Coculture of autogenic BMSCs with chondrocytes can promote the proliferation of chondrocytes and the production of chondral mat

8、rix. Cocultured cells for seeding can save a number of chondrocytes, shorten cultureperiods and reduce subculture times.Cocultured cells embedded into DBM can repair articular cartilage defects effectively.【Keywords】 bone marrowderived mesenchymal stem cells; chondrocytes; coculture techniques;demin

9、eralized bone matrix; articular cartilagerepair【摘要】目的： 探討自體骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)與軟骨細胞共培養(yǎng)復(fù)合同種異體脫鈣骨基質(zhì)（DBM）修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性，評價修復(fù)效果，為優(yōu)化種子細胞源提供依據(jù). 方法： 取濃度為5109/L的第二代BMSCs和軟骨細胞，按21比例混勻共培養(yǎng)作為種子細胞. DBM與共培養(yǎng)細胞復(fù)合植入修復(fù)為實驗組（A組），單純材料DBM組（B組）和不處理組（C組）作為實驗對照組. 移植8和16 wk后經(jīng)大體觀察、組織學(xué)評分和免疫組化染色評價缺損修復(fù). 結(jié)果： 共培養(yǎng)的軟骨細胞基質(zhì)合成豐富，細胞增殖快，共培養(yǎng)57

10、d兩種細胞比例達11以上. A組缺損修復(fù)組織呈軟骨樣，表面光滑平坦，與周圍軟骨整合的軟骨細胞更為成熟. B組和C組的修復(fù)組織呈纖維組織. 組織學(xué)評分表明A組優(yōu)于B, C兩組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）. 免疫組化染色顯示A組修復(fù)組織的細胞為透明軟骨樣細胞，柱狀排列，型膠原染色陽性，與周圍軟骨及軟骨下骨整合良好. 結(jié)論： 自體BMSCs與軟骨細胞共培養(yǎng)，BMSCs能增強軟骨細胞的增殖，促進軟骨細胞基質(zhì)合成，縮短軟骨細胞培養(yǎng)時間和減少傳代次數(shù)，可節(jié)省大量的軟骨細胞，與DBM復(fù)合后能有效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損.【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細胞；軟骨細胞；共同培養(yǎng)技術(shù)；脫鈣骨基質(zhì)；關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)0引言關(guān)節(jié)軟

11、骨缺損自身不能有效修復(fù)，組織工程技術(shù)為解決這一難題提供了新的思路. 但由于軟骨細胞來源不足嚴重制約了其應(yīng)用1. 以自體軟骨細胞作為種子細胞，取材部位受限，軟骨細胞培養(yǎng)增殖能力低，傳代培養(yǎng)容易引起老化和去分化2，而成體骨髓中骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）含量少，隨傳代次數(shù)的增多，成軟骨潛能明顯降低， Rubio等3研究證實BMSCs多次傳代培養(yǎng)有致瘤傾向. 我們應(yīng)用自體BMSCs和軟骨細胞共培養(yǎng)復(fù)合同種異體脫鈣骨基質(zhì)（demineralized bone matrix, DBM）修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損，并對修復(fù)組織進行評價

12、，為優(yōu)化種子細胞源提供實驗依據(jù).1材料和方法1.1材料DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物公司）；CO2孵育箱（恒溫培養(yǎng)箱，日本Sony公司）；膠原酶（美國Sigma公司）；相差顯微鏡（日本BH2型Olympus顯微鏡）；型膠原免疫試劑盒（武漢博士德生物公司）；青紫蘭兔（衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所提供）.1.2方法1.2.1BMSCs與軟骨細胞共培養(yǎng)取本研究所實驗室培養(yǎng)的第二代自體BMSCs，濃度為5109/L的懸浮液1 mL和相同濃度的軟骨細胞懸液0.5 mL （21）混勻，用含150 mL/LFBS的DMEM培養(yǎng)基在37飽和濕度條件下的CO2孵育箱中進行共

13、培養(yǎng)，待細胞匯合至單層用2.5 g/L胰酶消化與同種異體DBM復(fù)合.1.2.2同種異體DBM的制備處死同種青紫藍兔，取四肢骨干骺端及椎體松質(zhì)骨，剔除附著的肌肉及骨膜，-80冰柜中凍存72 h，參照文獻4的方法進行脫鈣后，再將骨塊置于乙醚和乙醇中脫脂各24 h，用無菌蒸餾水反復(fù)沖洗浸泡至中性，自然干燥后環(huán)氧乙烷消毒，4保存?zhèn)溆?1.2.3動物模型與實驗分組36個月齡的青紫蘭兔54只，體質(zhì)量1.01.5 kg，雌雄不限. 取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)弧形切口，向外翻開髕骨暴露膝關(guān)節(jié)，于股骨滑車關(guān)節(jié)面上用4 mm鉆頭鉆孔，深度約34 mm穿透軟骨下骨，有阻力感見新鮮血液溢出，造成全層關(guān)節(jié)軟骨缺損模型. 將動物隨機分

14、為A, B, C三個處理組，每組18只. A組于軟骨缺損處植入共培養(yǎng)細胞DBM（細胞均為自體細胞）；B組單純植入DBM；C組不作任何植入.1.2.4指標觀察相差顯微鏡下觀察共培養(yǎng)細胞的形態(tài)和增殖，并對共培養(yǎng)細胞爬片進行番紅0染色. 每組移植術(shù)后8和16 wk分別處死9只動物，取出膝關(guān)節(jié)對修復(fù)組織分別進行大體、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)觀測. 參照文獻5的評分標準，對術(shù)后8和16 wk各組動物分別進行組織學(xué)評分統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS10.0軟件包對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，各組間差異采用單因素方差分析，P0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.2結(jié)果2.1共培養(yǎng)細胞形態(tài)學(xué)觀察共培養(yǎng)細胞24 h后逐漸貼壁，軟骨細

15、胞呈橢圓形或三角形，大部分居混合細胞的中央，表面光滑，細胞體積變大，胞質(zhì)增多，細胞數(shù)量多增殖旺盛，細胞外基質(zhì)合成豐富被番紅0均勻染色;BMSCs細胞體積無明顯增大，散在于共培養(yǎng)細胞中，表面呈成纖維細胞樣染色陰性，所占比例逐漸降低. 共培養(yǎng)57 d，軟骨細胞與BMSCs比例達11以上（圖1）.圖1BMSCs和軟骨細胞共培養(yǎng)番紅0染色200(藍色箭頭示軟骨細胞，紅色箭頭示BMSCs)（略）2.2大體標本觀察術(shù)后所有動物切口愈合良好，關(guān)節(jié)液清亮，關(guān)節(jié)腔無粘連、滑膜增生、關(guān)節(jié)游離體及骨贅形成. A組： 術(shù)后8 wk缺損已由半透明、淡紅色組織填充，邊界模糊，表面光滑；16 wk與周圍軟骨色澤相近，表面平

16、整（圖2）. B組： 術(shù)后8 wk缺損區(qū)修復(fù)組織為乳白色，表面不光整，部分仍呈空洞；16 wk為纖維性修復(fù). C組：術(shù)后8 wk缺損區(qū)為纖維樣組織覆蓋，色澤暗灰；16 wk周圍軟骨呈蟲蝕樣改變.2.3組織學(xué)觀察A組： 術(shù)后8 wk修復(fù)組織細胞較多，以圓形透明軟骨樣細胞為主，有軟骨陷窩，表層有梭形成纖維樣細胞，與周圍軟骨結(jié)合，基底部較多新生骨形成；16 wk修復(fù)組織為透明軟骨樣，厚度接近正常，與周圍軟骨結(jié)合好，深層軟骨鈣化，與底層骨結(jié)合緊密，基質(zhì)著色正常，未見DBM殘留（圖3）. B組： 術(shù)后8 wk缺損組織細胞較少，細胞層次排列差；16 wk修復(fù)組織菲薄，呈纖維樣，與周圍軟骨未結(jié)合，基底部有少

17、量新生骨形成. C組： 術(shù)后8 wk缺損組織有薄層纖維組織覆蓋；16 wk缺損區(qū)纖維組織進一步增厚，與周圍軟骨未結(jié)合.術(shù)后8和16 wk A組評分均優(yōu)于B, C組（P0.05）. 圖2共培養(yǎng)細胞DBM修復(fù)關(guān)節(jié)缺損的大體觀察(箭頭示修復(fù)部位)（略）圖3共培養(yǎng)細胞DBM組修復(fù)關(guān)節(jié)缺損的組織學(xué)觀察甲苯胺蘭染色200(箭頭示修復(fù)組織)（略）2.4免疫組織化學(xué)術(shù)后16 wk時A組修復(fù)組織中細胞呈圓形或橢圓形，形體大柱狀排列，與周圍軟骨及軟骨下骨整合良好，細胞質(zhì)和細胞外間質(zhì)中型膠原染色陽性，出現(xiàn)棕黃色顆粒（圖4）；B組和C組修復(fù)組織未出現(xiàn)黃染的陽性區(qū)域.圖4免疫組織化學(xué)染色檢測共培養(yǎng)細胞DBM組修復(fù)組織的

18、型膠原DAB染色100(箭頭示修復(fù)組織)（略）3討論關(guān)節(jié)軟骨組織代謝活性較低，創(chuàng)傷和手術(shù)等所致的軟骨損傷或缺損難以自我修復(fù)或以纖維組織填充替代，影響關(guān)節(jié)功能的恢復(fù). 細胞生物學(xué)和生物材料技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)軟骨缺損成為可能，但是至今尚無一種細胞能完全滿足軟骨組織工程對種子細胞的要求6. Tsuchiya等7用人BMSCs與牛軟骨細胞按不同比例混合進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞的增殖速度和細胞外基質(zhì)的合成與BMSCs的比例呈正相關(guān). 我們通過BMSCs與軟骨細胞體外共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)的軟骨細胞比單獨培養(yǎng)的同代軟骨細胞體積大，增殖速度加快，有大量成熟的軟骨陷窩形成和基質(zhì)合成，說明BMSCs能

19、促進軟骨細胞的增殖和表型維持，因此，共培養(yǎng)使軟骨細胞快速增殖，這就節(jié)省了軟骨細胞的用量,避免了為獲取足夠量的軟骨細胞反復(fù)傳代培養(yǎng)而引起的軟骨細胞老化和去分化2. 而BMSCs體積變化不明顯或輕度縮小，并且連續(xù)培養(yǎng)后兩種細胞的比例仍可保持在21左右，說明軟骨細胞和BMSCs的增殖速度相接近，這與Tsuchiya等7的結(jié)果相似，這是否由軟骨細胞將BMSCs誘導(dǎo)成或?qū)⒎只癁檐浌羌毎⒑铣杉毎饣|(zhì)，尚需進行深入研究.單獨BMSCs在非軟骨環(huán)境下并不能構(gòu)建出軟骨組織，而用20%以上的少量軟骨細胞與BMSCs共培養(yǎng)可構(gòu)建出成熟的工程化軟骨，并且在軟骨濕重、糖胺多糖含量和軟骨特異性基質(zhì)表達等方面都優(yōu)于相同

20、數(shù)量的軟骨細胞構(gòu)建的軟骨，比用單獨軟骨細胞構(gòu)建軟骨組織可減少60%80%的軟骨細胞量,為解決軟骨細胞來源不足提供了切實可行的途徑8. 研究表明BMSCs和軟骨細胞共培養(yǎng)期間TGF3, BMP2, IGF1和FGF2等生長因子表達增加5.411.6倍不等，增強的活性因子介導(dǎo)軟骨細胞旁分泌或自分泌，可能是促進軟骨細胞增殖和表型維持的主要因素之一，Goldberg等9應(yīng)用含血清和TGF的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)軟骨細胞進行比較，結(jié)果也顯示TGF能使去分化的軟骨細胞重新分化和表型的維持，但具體的信號傳導(dǎo)及其途徑尚不清楚10-12.我們應(yīng)用BMSCs和軟骨細胞共培養(yǎng)與DBM復(fù)合移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，修復(fù)組織內(nèi)細胞

21、形態(tài)類似于透明軟骨細胞，細胞周圍有軟骨陷窩形成，免疫組化結(jié)果顯示為型膠原纖維，證實了修復(fù)組織為透明樣軟骨. 共培養(yǎng)復(fù)合物中的BMSCs直接分化為骨細胞直接與周圍的軟骨下骨進行骨與骨的整合，比單獨培養(yǎng)的軟骨細胞與軟骨下骨結(jié)合更加牢固，但修復(fù)組織與周圍正常軟骨仍有差別，主要表現(xiàn)為細胞數(shù)量多且排列紊亂，術(shù)后16 wk細胞數(shù)量減少并出現(xiàn)了柱狀排列趨勢，更接近于正常軟骨組織，可能是術(shù)后不限制關(guān)節(jié)活動，修復(fù)組織在局部應(yīng)力作用下發(fā)生改建所致13. B組軟骨缺損基底部也有新骨形成，是由于載體材料的存在使髓腔或松質(zhì)骨中的MSCs駐留在損傷區(qū)底部，進而分化成少量骨組織14.我們應(yīng)用的同種異體DBM是經(jīng)冷凍、脫脂、

22、脫鈣、去蛋白處理得到的產(chǎn)物，抗原性消除或大大降低，且保留了誘導(dǎo)軟骨形成的生長因子和膠原等基質(zhì)，有利于細胞增殖和分化. DBM為多孔海綿樣結(jié)構(gòu)，可提供寬大空間容納大量的種子細胞，利于細胞黏附、細胞外基質(zhì)沉淀、營養(yǎng)和氧氣的進入以及代謝產(chǎn)物的排出. DBM植入缺損部位后第四周開始吸收，完全吸收需812 wk，而軟骨形成需68 wk，因此DBM吸收和軟骨形成幾乎同步. 根據(jù)修復(fù)部位的不同可調(diào)整脫鈣時間，或部分脫鈣和表面脫鈣，能適應(yīng)不同部位的生物力學(xué)強度要求. 按修復(fù)缺損的形狀可剪成不同的形狀和大小，應(yīng)用方便. 同種異體DBM制備方法相對簡便可大量獲取，低溫下可長期保存建立DBM骨庫備用. 因此，DBM

23、是一種理想的軟骨組織工程支架材料4，15.BMSCs和軟骨細胞共培養(yǎng)，兩種細胞相互促進增殖和分化，作為種子細胞可減少軟骨細胞增殖傳代次數(shù)并節(jié)省軟骨細胞數(shù)量，與DMB復(fù)合能有效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，為優(yōu)化種子細胞源提供了實驗依據(jù)，但是共培養(yǎng)的兩種細胞間相互作用的機制及其調(diào)節(jié)機制尚不清楚，并且本實驗的動物模型是在正常關(guān)節(jié)面上造成缺損區(qū)進行的修復(fù)，有別于臨床上常見的大面積不規(guī)則缺損，因此對這些問題需要進一步研究和改進.【參考文獻】1 劉松波，胡蘊玉，徐虎，等. 柱形藻酸鈣載體復(fù)合細胞修復(fù)異體兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2001,22 (11):1010-1013.2 Marlovits S,

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