配位金屬離子手性添加劑拆分藥物對(duì)映體的機(jī)理

1、    配位金屬離子手性添加劑拆分藥物對(duì)映體的機(jī)理        摘要目的：為了較深入的闡述配位金屬離子手性添加劑拆分藥物對(duì)映體的機(jī)理。方法：本文運(yùn)用已建立的配位體交換液相色譜(CLEC)方法，以新型配位添加劑(R,R)-酒石酸-單-n-辛胺(TAMOA)為研究對(duì)象,將有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了總結(jié)和綜述,對(duì)其拆分機(jī)理及影響因素進(jìn)行了討論。結(jié)果：運(yùn)用這種方法進(jìn)行手性拆分,其機(jī)理為:首先拆分樣品與手性添加劑以共價(jià)鍵形成五(六)元比較穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu),同時(shí)手性添加劑（SE）,金屬離子（Me）,

2、外消旋分子（SA）之間形成多種平衡形式的中間配合物;然后,根據(jù)不同配合物在固定相上的保留時(shí)間的不同進(jìn)行拆分。結(jié)論：配位金屬離子手性添加劑CLEC方法拆分條件簡(jiǎn)單,成本低,可在手性藥物分析及手性單一體半制備中有廣泛的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞配位金屬離子；手性添加劑；藥物對(duì)映體中分類號(hào)R966文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào):1008-9926(2000)03-0140-05對(duì)映體之間表現(xiàn)出藥理學(xué)性質(zhì)上的差異，并非偶然現(xiàn)象，這與有機(jī)體內(nèi)存在著“手性環(huán)境” 密切相關(guān)。蛋白質(zhì)、酶、受體等生物大分子與手性藥物對(duì)映體作用，形成兩種非對(duì)映異構(gòu)體結(jié)合物，它們二者的物理性質(zhì)有顯著地差異。因此，可以預(yù)測(cè)手性藥物對(duì)映體之間在藥動(dòng)學(xué)、代

3、謝、轉(zhuǎn)化等方面具有不同的性質(zhì)。Ariens1概括了在藥理學(xué)和藥動(dòng)學(xué)研究中進(jìn)行藥物對(duì)映體監(jiān)測(cè)的重要性：一般而言，只有一種對(duì)映體具有療效，而另一種對(duì)映體很可能產(chǎn)生副作用。例如震驚世界的沙立度胺致畸事件，據(jù)研究認(rèn)為完全由于(S)-(-)異構(gòu)體所致。目前，醫(yī)藥生產(chǎn)中，手性藥物已超過(guò)50%，然而有近85%90%的手性藥物仍以外消旋(racemic durg)生產(chǎn)、出售和使用。因此，在臨床用藥和臨床藥理學(xué)特別是藥動(dòng)學(xué)研究中，若忽視對(duì)映體之間藥理作用上的差異，將付出昂貴的代價(jià)。本文就手性流動(dòng)相(CMP或CMAS)技術(shù)在手性藥物分析中的應(yīng)用，鍵合金屬配位離子形成新的流動(dòng)相體系中的重要性，及對(duì)藥物分析等方面的研

4、究有較大的意義，現(xiàn)將這項(xiàng)技術(shù)分離機(jī)理與近期進(jìn)展作一概述。1手性流動(dòng)相及配位基手性試劑的發(fā)展手性流動(dòng)相法(CSP)亦稱手性添加劑法(CMAS)，優(yōu)點(diǎn)是拆分化合物不需以手性試劑衍生，也不需價(jià)格昂貴的手性固定相（CSP)。而是將手性試劑加到流動(dòng)相中，使用常規(guī)的正相和反相柱分離。由于方法簡(jiǎn)便，引起了廣泛的注意，作用原理有兩種可能：(1) 溶質(zhì)在流動(dòng)相中手性試劑形成非對(duì)映絡(luò)合物，因而在固定相和流動(dòng)相中分配特性不同。(2)手性試劑吸附在柱上形成動(dòng)態(tài)的CSP2，拆分原理同CSP相似。氨基酸或其異構(gòu)體衍生物的分析技術(shù)，在醫(yī)藥，生物化學(xué)，化學(xué)和地球化學(xué)(geochemical)方面的研究不斷增加，其重要性不斷的

5、被人們認(rèn)識(shí)。特別是自1968年Davankov等3報(bào)道運(yùn)用配位體交換液相色譜(Chiral Ligand Exchange liquid Chromatography,CLEC)法分離光學(xué)異構(gòu)體，并在此領(lǐng)域內(nèi)作出了很大貢獻(xiàn)4。自此以后，CLEC方法被廣泛的應(yīng)用。除了氣相色譜(GC)方法中運(yùn)用氨基酸衍生物進(jìn)行測(cè)定光學(xué)異構(gòu)體D,L-比率外5。近幾年，運(yùn)用氨基酸衍生物在高效液相色譜(HPLC)中進(jìn)行光學(xué)異構(gòu)體分離及測(cè)定研究發(fā)展迅速。因此，液相色譜的手性流動(dòng)相添加劑法的越來(lái)越受到重視。2主要手性添加劑有以下幾類2.1蛋白質(zhì)由于蛋白質(zhì)類CSP對(duì)多數(shù)藥物有良好的拆分效果，白蛋白和AGP6、7曾作為手性添加

6、劑拆分某些精神藥物如異丙嗪，甲硫噠嗪及雙異丙吡胺等。Pettersson8用蛋白拆分了酸，二羧酸和色胺酸。2.2環(huán)糊精類（CD)以CD制成的CSP對(duì)多類化合物都有良好的拆分效果。Deboski9對(duì)CD拆分扁桃酸作為系統(tǒng)研究。Sykiska10等以CD拆分巴比妥類藥物，發(fā)現(xiàn)只有嘧啶環(huán)上有不對(duì)稱碳原子的巴比妥如美芬妥因，甲基苯巴比妥和海索巴比妥可以拆分。Nobuhara11和Gazadag12分別對(duì)流動(dòng)相的組成，添加劑的濃度及不同型號(hào)的C18柱對(duì)拆分的影響作了探索。2.3氫鍵型手性試劑Dobashi13以N-乙酰-L-纈氨酸-叔丁酰胺作為手性添加劑對(duì)多種氨基酸衍生物有較好拆分效果。2.4配位基手性

7、試劑Lindner14將金屬配合物L(fēng)-2-異丙基-4-N-乙酰二乙烯四胺-Zn2+加到流動(dòng)相中，使其動(dòng)態(tài)的吸附在C18柱上，可用于丹酰氨基酸的拆分。同年Hare15以L-proline-Cu2+為手性添加劑用陽(yáng)離子交換色譜拆分氨基酸，手性添加劑除L-氨基酸及其衍生物外，光學(xué)活性的胺和酰胺亦被采用16。溶質(zhì)與配位基及金屬離子生成兩個(gè)三元非對(duì)映絡(luò)合物，由于穩(wěn)定性或物理性質(zhì)的不同而達(dá)到拆分的目的。洗脫順序與一般反相離子一致，溶質(zhì)的疏水性增加，保留時(shí)間延長(zhǎng)，疏水性氨基酸拆分流動(dòng)相中應(yīng)加入一定量的有機(jī)該性劑，甲醇或乙腈。2.5手性離子對(duì)試劑這一方法是在離子對(duì)色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)，將一般試劑換成手性離子試

8、劑，即可用于有機(jī)酸和堿性對(duì)映體的拆分。以上所述的5種主要添加劑，拆分的樣品在不同添加劑的色譜柱上有不同的色譜行為，其應(yīng)用范圍和拆分機(jī)理也有一定的差別，國(guó)內(nèi)在配位基手性添加劑拆分機(jī)理綜述未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。較多的文獻(xiàn)報(bào)道為運(yùn)用環(huán)糊精添加劑1723，進(jìn)行藥物分離研究及環(huán)糊精流動(dòng)相添加劑的參數(shù)研究。但由于配位金屬離子手性添加劑與柱填料形成穩(wěn)定的和強(qiáng)吸附的手性固定相填料，拆分較完全，成本低，方法簡(jiǎn)便，因而其在藥物分析中的必將引起重要作用。近年來(lái)，運(yùn)用配位金屬離子手性試劑在配位基交換液相色譜（CLEC)方面進(jìn)行了較為廣泛地光學(xué)異構(gòu)體的分析方法研究。最初，CLEC手性配位基主要運(yùn)用二價(jià)金屬離子，而且人們主要選擇

9、Cu2+離子，與聚苯乙烯硅膠以共價(jià)鍵形式結(jié)合形成固定相。1976年后，Lindner和Karger等24報(bào)道了CLEC方面的進(jìn)展，自從建立了CLEC方法，隨后這種CLEC技術(shù)在反相體系中廣泛的應(yīng)用。在手性添加劑中加入金屬化合物，形成了穩(wěn)定的和強(qiáng)吸附的手性固定相的柱填料，具有較好的穩(wěn)定性，重現(xiàn)性，和普遍性。在許多CLEC體系中，一般將L-proline CuII作為流動(dòng)相添加劑類型。目前，我們正在進(jìn)行L-proline CuII作為流動(dòng)相添加劑拆分甲狀腺素的研究工作。但也有其它手性添加劑加入到流動(dòng)相中的研究工作報(bào)道15。3配位金屬離子手性流動(dòng)相添加劑拆分的原理在配位金屬離子手性流動(dòng)相添加劑拆分中

10、，許多-氨基酸和其衍生物被常常用作手性配位添加劑(chiral chelating selector)SE。同時(shí)，Cu2+與氨基酸或丹酰酸(L-AA,Dns-D)被廣泛的運(yùn)用于分離外消旋分子(racemic molecules)SA，而其它過(guò)渡金屬離子Zn(II)，Ni(II)，Cd(II)，Hg(II)比Cu(II)與SE和SA一起拆分外消旋分子的應(yīng)用少。主要與Cu(II)形成配合物的穩(wěn)定性有關(guān)。一般情況下，SE和SA與氨基酸形成的六元環(huán)比五元環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。這種現(xiàn)象基于與手性添加劑形成共價(jià)鍵，Davankov3使用這種配位形式解釋了與混合配位化合物中，同時(shí)形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的色譜結(jié)果。值得注意的是C

11、LEC與形成化合物的機(jī)理有關(guān)，通常認(rèn)為 SE和SA必須有一個(gè)分子適合與這種結(jié)構(gòu)見(jiàn)1，而且，應(yīng)考慮如配位基與幾何形狀等因素的改變，同時(shí)在CLEC中形成配位體結(jié)構(gòu)中應(yīng)注意以下的因素:(1)配位原子的性質(zhì)(N,O,P,S)；(2)配位原子的功能(如氨基酸,酰胺,乙腈中的N)；(3)形成環(huán)的大小(4,5,6,7-元環(huán))；(4)配位分子形成一定數(shù)目的配位環(huán)(如,二,三元環(huán))；(5)立體效應(yīng)由配位體分子(SE,SA)的光學(xué)活性的取代基所決定；(6)形成配位體的中心金屬的性質(zhì),氧化態(tài)和配位數(shù)(Cu2+,Ni2+,Zn2+,Co3+ect)；(7)溫度，溶質(zhì)，pH值和緩沖體系。因此，進(jìn)行手性流動(dòng)相添加劑的研究

12、工作應(yīng)注意上述各因素。目前，報(bào)道一種新的配位添加劑(R,R)-酒石酸-單-n-辛胺(TAMOA)(R,R)-tartaric acid mono-c-octylamide用于氨基酸異構(gòu)體的分離。TAMOA-Me配位體TAMOA-Me配位體結(jié)構(gòu)見(jiàn)1，配位原子為N,O，與金屬離子形成穩(wěn)定的七元環(huán)。1TAMOA-Me配位化合物的結(jié)構(gòu)手性分離機(jī)理，立體選擇鍵合現(xiàn)象(stereoselsctive binding phenomena)和CLEC流動(dòng)相中添加配位基的理論被認(rèn)為非常復(fù)雜，其原因在于色譜體系中存在多種平衡。討論手性配位交換色譜(CLEC)的影響因素，特別是流動(dòng)相添加劑類型，主要是緩沖鹽，氫氧離

13、子的濃度，水，有機(jī)調(diào)節(jié)劑，氨，金屬離子的鹽的濃度，配位試劑以及它們相互之間的比率。在TAMOA-Me配位體體系中，配位添加劑(TAMOA)和金屬離子(Ni2+)之間在保持其它色譜條件不變的情況下，兩者之間不同比率對(duì)分離結(jié)果影響的見(jiàn)表2。當(dāng)TAMOA和Ni2+摩爾濃度比為11時(shí)立體選擇的值最大，能得到最完全的分離。當(dāng)色譜條件為(0.09mmol.L-1TAMOA)固定時(shí)，TAMOA與Ni()-acetate的比例為12或(21)時(shí)，立體拆分為最低，其結(jié)果不僅受配位添加劑SE和配位基SA分子影響，而且與流動(dòng)相添加劑成分有關(guān)，特別與氨基離子和OH-有關(guān)。實(shí)際上,在CLEC色譜中，流動(dòng)相添加劑可能形成

14、許多平衡式。Lam25描述了最簡(jiǎn)單的立體選擇混合配位體形成的三齒配合物，金屬離子和兩個(gè)不同配位添加劑SE和拆分樣品SA形成的平衡形式。三元化合物的穩(wěn)定度可按下列公式表示:logK=2logSE-Me-SA-logSE-Me-SA-logSA-Me-SA三元混合物優(yōu)選形式，是由SE，Me，SA的濃度大小和logK值所描述，配位添加劑將不僅通過(guò)SE-Me-SE形成化合物所完成，而且也通過(guò)(D)-或(L)-SA分子完成，形成非對(duì)映體化合物。SE-M-(D)-SA和SE-M-(L)-SA結(jié)構(gòu)非常相似，其中間化合物可用結(jié)構(gòu)(J)表示。2已簡(jiǎn)述了整個(gè)配位交換的過(guò)程，是將傳統(tǒng)的概念進(jìn)行了延伸。表2TAMOA

15、(SE)的對(duì)映體選擇性與SE和金屬離子比例的關(guān)系(R,R)-()-TAMOA(mmol.L-1)(X)Ni()(mmol.L-1)(Y)o-Tyrm-Tyrp-TyrpheGlyST 1059k'LkDkLk'Dk'Lk'Dk'Lk'Dk'Lk'D0.91.8017.21.009.51.004.71.00010.71.000.90.9014.713.91.007 0.90.4511.31.006.81.003.21.004.85.71.

16、206.21.001.80.9031.01.0014.31.009011.811.21.052流動(dòng)相添加劑中配位體離子交換機(jī)理模型由2可見(jiàn)，流動(dòng)相中主要拆分樣品的濃度和手性添加劑（如TAMOA)都被吸附在固定相上，有廣泛均勻的分布，且有一定的保留時(shí)間。當(dāng)TAMOA濃度增加時(shí)，在流動(dòng)相中TAMOA限度由TAMOA-Me離子化合物的溶解度決定。它變化很明顯，TAMOAMe離子比為21時(shí)，光學(xué)選擇性的保留時(shí)間將比TAMOAMe為11時(shí)增加。因此，可以通過(guò)上述結(jié)果預(yù)測(cè)到，對(duì)于SA分子如果產(chǎn)生較多的立體位置，從而保留時(shí)間也會(huì)增加。早時(shí)我們注意到，如果一個(gè)配體(I)

17、與SE分子發(fā)生交換，保留時(shí)間就由被吸附在固定相上的大量化合物SE-Me-SE和SE-Me-I所決定，做一個(gè)相反的試驗(yàn)，金屬離子的濃度為SE的兩倍時(shí)(TAMOAMe=12)，保留時(shí)間也增加，而且對(duì)應(yīng)產(chǎn)生大量的SE-Me-SE和SE-Me-I，同時(shí)，SA以配合劑所保留，這樣I-Me-SA化合物的保留時(shí)間將雙倍增加，但并不是光學(xué)選擇。若I-Me-I化合物的穩(wěn)定常數(shù)將很低，無(wú)論I的濃度比SE的濃度高多少，僅有SE-Me-SE結(jié)構(gòu)存在，這種結(jié)果證實(shí)了產(chǎn)生了大量立體選擇的正確性，同時(shí)在立體選擇時(shí)還伴隨相對(duì)量較低的SE-Me-SE和/或SE-Me-I分子，假定化合物SE金屬離子為11時(shí)，其結(jié)果與Feibus

18、h et al26報(bào)道的一致。文獻(xiàn)報(bào)道了一個(gè)在CLEC固定相鍵合的新概念“稀鍵”(dilute bond)，這樣就避免了形成21化合物(SE-Me-SE)的形成，其結(jié)果是在優(yōu)化的光學(xué)選擇性和較高的柱效條件下獲得的，其中間配位體交換較SE配位體迅速。下面在光學(xué)體分離方面介紹采用配位體交換的機(jī)理，討論金屬離子配位劑。如果金屬離子存在，含有中心金屬配位劑的化合物將被洗脫出來(lái)。在CLEC體系中，流動(dòng)相添加劑中洗脫劑和溶劑峰是非對(duì)映體SE-Me-(L)-SA和SE-Me-(D)-SA，若SE和I交換，則化合物I-Me-(L)-SA和I-Me-(D)-SA是與上述結(jié)果相一致。在相同的條件下，SE或I被SA

19、替換，相同的結(jié)構(gòu)(L-,D-)更適合于SA分子的構(gòu)型，其他異構(gòu)體的成分多少以色譜峰的大小體現(xiàn)。因此，形成L-SA-Me-(L)-SA化合物的峰，被(L)-pake所描述。無(wú)論如何，如果手性添加劑SE與主骨架形成共價(jià)鍵，可通過(guò)比較配位交換機(jī)理，使人們來(lái)認(rèn)識(shí)光學(xué)體分離。因此，(L)-峰洗脫部分其 包括(L)-SE-Me-(L)-SA和I-Me-(L)-SA化合物的分子。SE和SA分子在親脂性體系中，可替換和相互交換，但是相對(duì)平衡。如果是這樣，SA可作為另一個(gè)SA的手性選擇者，形成SA-Me-SA化合物。采用含有非手性的SE分子流動(dòng)相或結(jié)合到主骨架上，將(非等量D,L-)的手性的混合非消旋液進(jìn)樣，易

20、受影響的同分異構(gòu)體(L-形式)作為手性選擇者，在這樣情況下，將形成下列混合配位體化合物：(1) (L)-SA-Me-(L)-SA，(2) (L)-SA-Me-(D)-SA和(3) (D)-SA-Me-(D)-SA其中(1)和(3)的結(jié)構(gòu)形成相互對(duì)映體，非消旋體的化合物結(jié)構(gòu)為(2)，在化合物穩(wěn)定常數(shù)和親脂性方面(2)和(1)(3)不同，后來(lái)結(jié)果中(L)-SA和(D)-SA都有可能存在，特別是當(dāng)(D)-SA比(L)-SA量較小時(shí)，化合物(3)(D)-SA-Me-(D)-SA比化合物(1),(2)的量可以忽略不計(jì)。光學(xué)異構(gòu)體分離的概念是一般的稱法，由流動(dòng)相中非對(duì)映分子形成與光學(xué)添加劑(SE)化合而成

21、。手性流動(dòng)相添加劑技術(shù)在非水體系(non-aqueous systems)的研究Hara等人文獻(xiàn)27已報(bào)道，一般形成的非對(duì)映分子化合物，主要通過(guò)氫鍵力和極化極化作用力而形成。4拆分進(jìn)展配位金屬離子交換色譜(Ligand metal exchange chromatography)通過(guò)溶質(zhì)配位體和金屬離子，將第二個(gè)配位體引入色譜體系，優(yōu)先選擇混合配位化合物，來(lái)影響分離效果。異構(gòu)體配位立體選擇溶液，通過(guò)體系的配位體是否具有光學(xué)活性和與金屬離子形成手性配合物來(lái)完成手性拆分。在手性拆分的研究工作中，配位金屬離子手性試劑已成為最活躍的一類手性選擇試劑，在CEC中也可鍵合到毛細(xì)管壁上。隨著人們對(duì)它和被分析

22、物結(jié)構(gòu)關(guān)系的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，實(shí)驗(yàn)操作優(yōu)化分析方法的發(fā)展，許多文獻(xiàn)報(bào)道2835運(yùn)用氨基酸及其衍生物進(jìn)行手性配位體離子交換色譜的拆分，以及在其它分離模式中的運(yùn)用。因此，可以預(yù)測(cè)，配位金屬離子手性添加劑必將在手性拆分的研究工作發(fā)揮更大的作用。)王榮，男，1969年2月生。理學(xué)碩士，主管藥師。王榮（中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科甘肅蘭州730050）謝景文（中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科甘肅蘭州730050）賈正平（中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科甘肅蘭州730050）謝華（中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科甘肅蘭州730050）胡曉麗（中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)軍醫(yī)學(xué)院教務(wù)部甘肅蘭

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32、8梁宏浠,DG Durham.HPLC-環(huán)糊精手性流動(dòng)相添加劑的研究.包合穩(wěn)定常數(shù)對(duì)分配比的影響J.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998;29(2):11819謝劍煒,楊造萍,阮金秀.手性藥物對(duì)映體的環(huán)糊精手性流動(dòng)相固定相HPLC法拆分J.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1998;33(2):14320梁宏浠,DG Durham.HPLC-環(huán)糊精手性流動(dòng)相添加劑的研究.-環(huán)糊精手性選擇性包合穩(wěn)定常數(shù)的簡(jiǎn)單計(jì)算及驗(yàn)證J.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997;28(4):21821梁宏浠,DG Durham.HPLC-環(huán)糊精手性流動(dòng)相添加劑的研究.RP-HPLC系統(tǒng)中-環(huán)糊精與甲基苯巴比妥的手性選擇性包合J.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997;2

33、8(2):8222梁宏浠,DG Durham.HPLC-環(huán)糊精手性流動(dòng)相添加劑的研究.-環(huán)糊精及其甲基衍生物在ODS固定相上的吸附J.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998;28(1):3123姚彤煒,曾蘇,丁海青.手性流動(dòng)相添加劑法測(cè)定5-(對(duì)-羥基苯基)-5-苯基乙內(nèi)酰脲的體外代謝的立體選擇性J.浙江醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1996;25(5):19724Lepage.J,Lindner.W,Davies.G,et al.Resolution of the optical isomers of Dansyl amino acids by reversed phase liquid chromatography

34、with optically active metal chelate additivesJ.Anal.Chem,1979;51:43325Lam.S.Stereo selective analysis of D and L-dansyl amino acids as the mixed chalet copper() complexes by HPLCJ.J.Chromatogr.Sci,1984;22:41626Feibush.B,Cohen.M.J，Karger.B,The role of bandes phase completion on the ligand-exchange chromatrography of Dansyl-D,L- amino acidsJ.J.Chromatgr,1983;282:327Dobashi.V,Dobashi.A，Hara.S.Chiral recognition conducted by tartaric acid derivatives in nonaqueous mediaJ.Tetrahedron Lett,1984;25:32928Yamazaki.S,Takeuchi.T，Tanimura.T,Direct enantiomeric separ