人肝再生增強因子CXXC活性結構的研究

1、人肝再生增強因子CXXC活性結構的研究*中國生物工程雜志China Biotechnology, 2006, 26(2):2528潘艷1,2佟明華1鞠桂芝2孔祥平1*(1 解放軍458醫(yī)院全軍肝病中心廣州510602)(2 吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生部放射生物學重點實驗室長春130021)摘要人肝再生增強因子(human augmenter of liver regeneration, hALR)蛋白序列中有一段保守的CysXaaXaaCys (CXXC)氨基酸序列，針對hALRp的CXXC結構，對hALR分別進行C65A和Q88C突變，表達、純化突變體蛋白。體外檢測hALRp和突變體的黃素腺嘌

2、呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)輔助的巰基氧化酶活性，hALRFAD和hALRQ88CFAD組與對照組比較有顯著差異(P<0.05)，hALRFAD和hALRQ88CFAD組之間無差異；hALRC65AFAD組與對照組比較無差異。結果顯示，通過C65A突變將CXXC結構破壞后，該突變體的巰基氧化酶活性完全喪失；通過Q88C突變增加一個CXXC序列后，該突變體的巰基氧化酶活性較hALRFAD未見明顯增加；同時，F(xiàn)AD不僅是hALRp發(fā)揮巰基氧化酶活性必須的輔助因子，而且有助于hALRp突變體蛋白的復性。關鍵詞肝再生增強因子巰基氧化酶活性結構域中

3、圖分類號Q816收稿日期：20050627修回日期：20051123*廣東省自然科學基金重點項目(04103063)* 通訊作者，電子信箱：xiangpingkong肝再生增強因子蛋白 (augmenter of liver regeneration protein, ALRp)是ERV1(essential for respiration and viability 1, ERV1)/ALR蛋白質家族成員之一1。該家族成員兼具生長因子和巰基氧化酶活性。其蛋白序列中均有一段保守的CysXaaXaaCys (CXXC)氨基酸序列，CXXC結構域幾乎代表了ERV1/ALR蛋白家族活性位點2,3。那

4、么，CXXC結構域對于ALRp具有巰基氧化酶活性是否必需，是否僅考慮CXXC結構域對其酶活性的影響即可。本文采用定點突變方法對hALRp分別進行兩種類型的突變，一種破壞CXXC結構，另一種增加一個模擬的CXXC結構，檢測hALRp和突變體的體外巰基氧化酶活性，旨在觀察 CXXC結構域對hALRp巰基氧化酶活性的影響；并初步探討FAD在hALRp中的作用。1材料和方法1.1材料hALRp本室克隆、表達、純化、鑒定；Quikchange SiteDirected Mutagenesis Kit為STRATAGENE公司產品；FAD、2巰基乙醇、DTNB、DTT為Sigma公司產品；GSH日本進口分

5、裝；DEAESephadex FF凝膠、Sephadex G25凝膠柱為Amersham公司產品；定點突變引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成。1.2定點突變位點確定通過體外定點突變將Cys62XXCys65結構的Cys65進行C65A突變，以破壞CXXC結構。另外，在人ALRp晶體結構中，C74和C85不參與成鍵4。將ALR的Cys85后第3位氨基酸Glu88進行Q88C突變，模擬形成CXXC結構。1.3ALR定點突變按Quikchange SiteDirected Mutagenesis Kit要求設計并合成引物：ALRC65A引物1：5TTTTACCCCTGTGAGGAGGCCGCTGA

6、AGACCTAAGAAAAAGG3引物2：5CCTTTTTCTTAGGTCTTCAGCGGCCTCCTCACAGGGGTAAAA3ALRQ88C引物1：5CGGGCATGCTTCACATGCTGGCTGTGCCACCTGC3引物2：5GCAGGTGGCACAGCCAGCATGTGAAGCATGCCCG3劃線處為突變位點。以pBV220hALR為模板質粒，操作步驟按試劑盒要求進行。挑單克隆菌落穿刺，交上海生工生物工程技術服務有限公司測序。2006, 26(2)潘艷 等：人肝再生增強因子CXXC活性結構的研究中國生物工程雜志 China Biotechnology Vol.26 No.2 2006

7、1.4hALR與FAD結合hALRp與過量FAD混合，37°C過夜，Sephadex G25凝膠柱去除未結合FAD。收集ALRFAD，在450nm波長下測A450值，并用考馬司亮蘭法測蛋白濃度。根據所測A450值與蛋白濃度計算hALRp與FAD結合比例。1.5hALRC65A樣品的制備按文獻5所述方法進行，SDSPAGE檢測。1.6hALRQ88C樣品的制備根據包涵體重量估算蛋白摩爾數。將過量FAD溶入1.5節(jié)所述復性液中，其余步驟與1.5節(jié)所述相同，SDSPAGE檢測。1.7hALRp及其突變體FAD輔助的巰基氧化酶活性測定按1.4所述方法將hALRp和ALRC65A蛋白與FAD結

8、合。以DTT為底物，底物中的游離巰基與5,5二硫雙(2硝基苯甲酸) 5,5 dithiobis(2nitrobenzoic acid), DTNB反應，生成黃色的5硫代2硝基苯甲酸陰離子，于412nm波長處測定吸光度，通過換算計算巰基濃度。實驗分6組(表1)：hALR組；hALRFAD組；hALRC65AFAD組；hALRQ88CFAD組；FAD組；對照組。樣品均勻混合，反應于37°C進行，具體方法參見文獻6。表1巰基氧化酶活性測定實驗各反應體系的組成Table 1The component of reaction system in the test of sulfhydryl o

9、xidase activityhALR組hALRFAD組hALR C65AFAD組hALR Q88CFAD組FAD組對照組蛋白樣品100g100g100g1002結果2.1hALR定點突變、克隆和序列分析以PBV220hALR為模板進行定點突變后，挑單克隆菌落進行測序分析，結果顯示，兩個克隆均為正確突變克隆，除突變部位外其余序列與ALR序列完全一致。測序結果見圖1(a.b)：圖1ahALRC65A測序結果 (劃線處為突變點)Fig. 1aDNA sequencing result of hALRC65A (The mutated bases are underlined)圖1bhALRQ88C

10、測序結果 (劃線處為突變點)Fig. 1bDNA sequencing result of hALRQ88C (The mutated bases are underlined)2.2hALRp與FAD結合比例hALRFAD樣品于450nm波長下A450值為0083，F(xiàn)AD濃度為8.3mol/LFAD的消光系數為10 m(mol/l)-1·cm-1；蛋白濃度為0.334mg/ml，摩爾濃度為22.26mol/L。hALRp與FAD的結合比例為2682(ALR)1(FAD)。2.3hALR突變體蛋白樣品制備將表達菌體和精致包涵體電泳，圖像經BandScan凝膠圖像分析軟件分析，hALR

11、C65A和hALRQ88C表達菌體目的蛋白表達量分別為34.9%和38.6%，精致包涵體純度分別為82.9%和71.6%。純化的蛋白樣品電泳結果見圖2，純度分別為93.2%和90.7%。圖2hALR C65A和hALR Q88C蛋白SDSPAGEM: 蛋白質分子量標準；1: hALRC65A蛋白;2: hALRQ88C蛋白Fig. 2SDSPAGE analysis of hALRC65Aand hALRQ88C protein2.4hALRp及其突變體體外巰基氧化酶活性測定如圖3所示，hALRFAD組與hALRQ88CFAD組巰基濃度隨時間推移不斷降低，5min后與對照組比較即有顯著性差異(

12、P<0.05)；其余各組巰基濃度在不同時間點未見明顯降低；hALRFAD和hALRQ88CFAD兩組在各時間點巰基濃度均沒有明顯差異。FAD和無蛋白對照組是為了排除其他因素對巰基的氧化作用。圖3以DTT為底物的巰基氧化酶活性實驗各組巰基濃度-時間曲線± s. n=3. #： P<0.05; *： P<0.01 vs controlFig. 3Concentration of thiol groups (mol/L) was measured at listed time points when use DTT as substrate3討論1.5節(jié)所述蛋白制備方法是

13、本室摸索的hALRp制備工藝。按該方法制備hALRC65A蛋白電泳顯示分子量與理論值吻合。但hALRQ88C蛋白電泳顯示其分子量與理論值不符。將這種hALRQ88C樣品按1.4節(jié)所述與FAD結合后，得到的樣品為無色。說明按照原有工藝制備的hALRQ88C蛋白不能與FAD結合。hALRp二聚體共有16個半胱氨酸，其中有6對二硫鍵和4個游離的半胱氨酸4。hALRQ88C是在每個單體上增加一個半胱氨酸。增加的半胱氨酸在hALRp中如何參與成鍵尚不清楚，但卻使hALRp高級結構更為復雜。因此，對于hALRp適用的制備工藝不適用于hALRQ88C蛋白樣品制備，導致在復性過程中蛋白質有部分不正確折疊，也導

14、致與FAD不結合。采用1.6節(jié)所述方法制備hALRQ88CFAD蛋白，結果顯示hALRQ88CSephadex FF陰離子交換柱和Sephadex G25凝膠柱處理，最后得到的樣品顏色為明亮的淺黃色，說明在復性中hALRQ88C蛋白即與FAD結合，同時FAD對于Q88C在復性過程中的正確折疊可能起到了一定的作用。Gerber等7報道ERV1p/ALRp家族中ERV2p與FAD以化學計量為11的比例相互結合，本實驗計算hALRp與FAD結合比例為2.681，原因可能是由于本實驗是通過包涵體的體外變性復性得到的蛋白，復性過程中蛋白質的半胱氨酸在配對成鍵的過程中發(fā)生了偏差，而蛋白質肽鏈的CXXC結構

15、是hALRp與FAD非共價結合位點，因此部分不正確的二硫鍵會影響兩者的結合比例。以DTT為底物的巰基氧化酶實驗結果顯示hALRC65A蛋白酶活性幾乎完全喪失，說明CXXC結構域在hALRp發(fā)揮巰基氧化酶活性必不可少的結構。為了進一步探討CXXC結構域在hALRp中的作用，通過Q88C突變在hALRp增加一個模擬的CXXC結構域，來觀察hALRp酶活性是否有明顯變化。但結果顯示，hALRQ88C蛋白與hALRp的巰基氧化酶活性并沒有顯著差別，說明hALRp的酶活性是由于包括CXXC結構域在內的多種因素共同作用的結果。雖然CXXC結構在hALRp酶活性方面起了非常重要的作用，但單純考慮CXXC結構

16、的作用還是遠遠不夠的。參考文獻1 Giorda R, Hagiya M, Seki T, et al. Analysis of the structure and expression of the augmenter of liver regeneration (ALR) gene. Mol Med, 1996, 2(1):971082 Lisowsky T, Lee J E, Polimeno L, et al. Mammalian augmenter of liver regeneration protein is a sulfhydryl oxidase. Dig Liver Dis,

17、 2001, 33(2):1731803 Hoober K L, Thorpe C. Egg white sulfhydryl oxidase: kinetic mechanism of the catalysis of disulfide bond formation. Biochemistry, 1999, 38(10):321132174 Farrell S R, Thorpe C. Augmenter of liver regeneration: a flavindependent sulfhydryl oxidase with cytochrome c reductase activ

18、ity. Biochemistry, 2005, 44(5):153215415 李茹冰，孔祥平，曾平魯，等. 重組人肝增強因子的純化及鑒定. 肝臟, 2001, 6(S1):105Li R B, Kong X P, Zeng P L, et al. Ganzang, 2001, 6(S1):1056 Lee J, Hofhaus G, Lisowsky T. Erv1p from Saccharomyces cerevisiae is a FADlinked sulfhydryl oxidase. FEBS Lett, 2000, 477(12):62667 Gerber J, Muhlen

19、hoff U, Hofhaus G, et al. Yeast ERV2p is the first microsomal FADlinked sulfhydryl oxidase of the Erv1p/Alrp protein family. J Biol Chem, 2001, 276(26):2348623491Study on the CXXC Activity Motif of HumanAugmenter of Liver RegenerationPAN Yan1,2TONG Minghua1JU Guizhi2KONG Xiangping1(1 Center of Infec

20、tious Disease, the 458th Hospital of PLAGuangzhou510602, China)(2 MH Radiobiology Research Unit, School of Public Health, Jilin UniversityChangchun130021, China)AbstractHuman augmenter of liver regeneration protein (hALRp) had a fragment of CysXaaXaaCys (CXXC) amino acid sequence. In order to study the CXXC activity motif ALRp, the amino acid at the position of 65 and 88 in hALRp was exchanged against alanine and cysteine respectively, and then expressed and purified mutagenesis protein. The sulfhydryl oxidase activity of ALRp and its mutagenesis in vitro were detected. The c