低劑量照射治療免疫介導(dǎo)性再生障礙性貧血的實(shí)驗(yàn)研究

1、低劑量照射治療免疫介導(dǎo)性再生障礙性貧血的實(shí)驗(yàn)研究 08-03-04 14:07:00 編輯：studa20 作者：劉洪濤,趙鈞銘,褚建新【摘要】 免疫介導(dǎo)性再生障礙性貧血（immunomediated aplastic anemia, IMAA）時淋巴細(xì)胞處于激活狀態(tài)，被抑制的造血干細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，據(jù)此本研究探討一項(xiàng)新的治療IMAA的策略，即利用激活的淋巴細(xì)胞和靜止的造血干細(xì)胞對放射敏感性的差異，給IMAA小鼠低劑量全身照射，此低劑量照射既可殺滅免疫活性淋巴細(xì)胞，解除它對造血干細(xì)胞的抑制，又不損害造血干細(xì)胞，從而使造血得以恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫介導(dǎo)性再生障礙性貧血小鼠模型完成，于造模后第4天全身

2、照射150 cGy，以不治療照射組和單純照射組小鼠為對照，觀察各組小鼠生存時間和生存率、血象和骨髓有核細(xì)胞數(shù)、骨髓和淋巴組織的病理形態(tài)改變。結(jié)果表明： IMAA組小鼠活存率為12.5%，平均存活時間為27.413.4天，照射治療組活存率為100%，平均存活時間60天以上，單純照射組無死亡；外周血白細(xì)胞數(shù)： IMAA組呈進(jìn)行性下降，直至死亡，照射治療組第10天與免疫再障組相似，以后開始緩慢回升，基本上達(dá)到治療前水平；紅細(xì)胞比容：未治療IMAA組于14天后呈進(jìn)行性降低, 至第35天比實(shí)驗(yàn)前減低2/3，照射治療組與單純照射組一樣，第14天有輕度減低隨后升高，至35天接近正常；骨髓有核細(xì)胞數(shù)： IMA

3、A組呈進(jìn)行性減低，無恢復(fù)趨勢，照射治療組于一過性減低后迅速增加，第28天達(dá)到正常水平；骨髓和淋巴組織病理形態(tài)觀察： IMAA組小鼠呈典型再生障礙性貧血病理改變，骨髓造血衰竭，脾臟明顯萎縮，而照射治療組于第28天骨髓和脾淋巴臟組織基本上恢復(fù)正常。結(jié)論：低劑量全身照射對IMAA小鼠有明顯的治療作用，骨髓和淋巴組織完全恢復(fù)；其療效機(jī)制可能與低劑量照射殺滅免疫活性淋巴細(xì)胞解除了對造血干細(xì)胞的抑制有關(guān)。本研究結(jié)果不僅為免疫介導(dǎo)性再生障礙性貧血提出了一種新的治療對策，而且為免疫介導(dǎo)性再生障礙性貧血機(jī)制的研究提供了新線索，在文獻(xiàn)中尚未見有類似報道。 【關(guān)鍵詞】 低劑量照射免疫介導(dǎo)性再生障礙性貧血 小鼠免疫活

4、性細(xì)胞Experimental Study of Low Dose Irradiation for Treatment of ImmunoMediated Aplastic Anemia in Mice Abstract As the lymphocytes of immunomediated aplastic anemia (IMAA) are in active state, and the hematopoietic stem cells are in silence, this study was aimed to design a new strategy to treat IMAA

5、. To utilize the difference of radiosensitivity between active lymphocytes and silent hematopoietic stem cells, the animals suffered from IMAA were treated with a single low dose of irradiation, killing the active lymphocytes to release its suppression to hematopoietic stem cells without injuring th

6、e hematopoietic stem cells. Therefore, the hematopoiesis can be restored. Experiments were completed in IMAA mouse model. At day 4 after making IMAA, the model mice were giren total body irradiation of 150 cGy, the nontreated model mice and normal mice irradiated with 150 cGy were used as control. T

7、he survive time and survive rate of mice, blood picture, the account of nucleated cell of bone marrow, and pathological changes of bone marrow and lymphoid tissues of each group mice were observed. The results were as follows: (1) Survive rate of IMAA mice in nontreated group was 12.5%, the average

8、survive time was 27.413.4 days. 100% of IMAA mice in irradiationtreated group survived over 60 days. The mice of irradiation control group all survived. (2) The account of WBC of IMAA mice in nontreated group dramatically decreased until to die, and in the irradiationtreated group it was gradually i

9、ncreased since the 10th day after treatment and close to normal level at the 28th day. (3) The RBC hematocrit of IMAA mice in nontreated group progressively decreased at day 14, and IMAA mice of irradiationtreated group gradually recovered closely to normal level after slightly fall at day 14, simil

10、ar to the mice of irradiation control group. (4) The account of nucleated cells of bone marrow in nontreated IMAA mice dramatically decreased, and in the IMAA mice of the irradiationtreated group it was rapidly increased following transient fall, and restored to normal. (5) Pathological obser vation

11、s showed that the bone marrow and spleen of nontreated IMAA mice demonstrated typical aplastic anemia pattern, including bone marrow failure, marked splenatrophy, but the bone marrow and lymphoid tissues in the IMAA mice of irradiationtreated group were recovered to normal at day 28 after treatment.

12、 It is concluded that the low dose of irradiation displayed a significant therapeutic effect to IMAA mice, their hematopoisis could be completely restored to normal. The mechanism of therapeutic effect may contribute to low dose of irradiation killing the immunocompetent lymphocytes, therefore, supp

13、ressing hematopoiesis. The experiment results not only set up a new strategy for IMAA treatment, but also provided a clue to study the mechanism of IMAA. Key wards low dose irradiation; immunomediated aplastic anemia; immunocompetent lymphocytes 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志 J Exp Hematol 2007; 15(3)低劑量照射治療免疫性再生障礙性貧血的實(shí)

14、驗(yàn)研究 近年來的研究證明，免疫介導(dǎo)性再生障礙性貧血（immunomediated aplastic anemia, IMAA)的骨髓造血干細(xì)胞的質(zhì)量無明顯異常，主要是T淋巴細(xì)胞數(shù)量與功能的異常，以及異常T細(xì)胞克隆的產(chǎn)生。這些異常改變在IMAA發(fā)生發(fā)展中起重要作用1-5。采用免疫抑制治療對于這種類型的AA具有明顯的治療效果 6-8，但免疫抑制劑的副作用較大，例如應(yīng)用療效較好的抗胸腺球蛋白，患者也常因高熱不退而難以堅(jiān)持治療。 本研究根據(jù)IMAA發(fā)生的機(jī)制，即淋巴細(xì)胞（主要為T淋巴細(xì)胞）處于激活狀態(tài)，直接或產(chǎn)生淋巴因子間接地對造血干細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用，從而導(dǎo)致骨髓各系造血細(xì)胞減少。也就是說，在IMA

15、A發(fā)生過程中，免疫淋巴細(xì)胞處于激活狀態(tài)，造血干細(xì)胞處于抑制或靜止?fàn)顟B(tài)。眾所周知，淋巴細(xì)胞，特別是激活狀態(tài)的淋巴細(xì)胞對輻射比較敏感，而處于抑制或靜止?fàn)顟B(tài)的造血干細(xì)胞對輻射不甚敏感。本研究利用淋巴細(xì)胞與造血干細(xì)胞對放射敏感性的差異提出了一項(xiàng)治療IMAA的新設(shè)想，即選擇適當(dāng)?shù)姆派鋭┝繉γ庖咴偕系K性貧血小鼠進(jìn)行全身照射，一方面殺滅或抑制激活的淋巴細(xì)胞，解除其對造血干細(xì)胞的負(fù)性調(diào)控作用，另一方面又不至損傷骨髓造血干細(xì)胞，使造血干細(xì)胞能增殖和分化，恢復(fù)正常造血功能，達(dá)到治療免疫再障的目的。 為了驗(yàn)證這一設(shè)想，我們以IMAA小鼠為模型，探討了不同放射劑量和不同治療時間的效應(yīng)，最終確定了造模后第4天全身照射

16、150 cGy作為治療方案，并獲得了理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。經(jīng)放射治療的IMAA小鼠的存活率達(dá)到100，生存時間在60天以上。本研究為探討IMAA治療提供一種新的治療途徑，在國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見有類似報道。 材料和方法 實(shí)驗(yàn)動物 受體小鼠：BALB/c小鼠（H2d，MLSb），8-12周齡，20-25 g，雌性。 供體小鼠：DBA/2小鼠（H2d，MLSa），6-14周齡，18-20 g，雌雄兼用；作為淋巴細(xì)胞供者。上述兩種小鼠均購自北京中國醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動物研究所。 試劑 Hanks液，白細(xì)胞分離液，小鼠CD3、CD4、CD8單克隆抗體，NH4Cl Tris液，臺盼藍(lán)等均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)病

17、理室和免疫室提供。 照射條件 采用銫源 射線照射 （Gammacell Canada），劑量率為89.2 cGy/min，對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行全身照射。 胸腺淋巴結(jié)細(xì)胞懸液制備 將DBA/2小鼠斷頸處死后，在無菌條件下取出胸腺和腸系膜淋巴結(jié)，分別剪碎、沖洗、4號針頭抽吸，使之成為單細(xì)胞懸液。經(jīng)臺盼藍(lán)拒染試驗(yàn)，活性細(xì)胞為95%以上；將胸腺與淋巴結(jié)細(xì)胞按12混合，配制成濃度為5106/ml的淋巴細(xì)胞混合液，4保存待用。 小鼠IMAA模型的建立 依照姚軍等9并參考周永明等10的方法稍加改進(jìn)，受體BALB/c小鼠全身照射劑量由600 cGy改為500 cGy，于照射后4小時內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸入取自DBA/2小鼠胸

18、腺、淋巴結(jié)的混合細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)為1106/只，AA小鼠發(fā)病率為100%，生存時間比姚軍等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯延長，有利于觀察本實(shí)驗(yàn)治療方案的療效。 實(shí)驗(yàn)方案和分組 單純照射組 18只小鼠，9只觀察生存期，9只動態(tài)活殺檢測。BALB/c小鼠全身照射500 cGy，不作任何處理。 IMAA模型組 17只小鼠，8只觀察生存期，9只動態(tài)活殺檢測。BALB/c小鼠經(jīng)500 cGy全身照射后4小時內(nèi)，經(jīng)尾靜脈注射DBA/2小鼠的胸腺淋巴結(jié)混合細(xì)胞懸液（1106/只）。 照射治療組 17只小鼠，8只觀察生存期，9只動態(tài)活殺檢測。小鼠AA模型復(fù)制與IMAA模型組相同，于制模后第4天全身照射150 cGy。為探討照射最佳時間和照射劑量，我們曾觀察了制模后第5天照射150 cGy或200 cGy和第4天照射150 cGy或200 cGy后小鼠狀態(tài)。這些小鼠一般狀態(tài)較差，白細(xì)胞數(shù)低，死亡率高（結(jié)果未列入），以第4天給予150 cGy照射療效最佳，故本實(shí)驗(yàn)選擇該治療方案進(jìn)行。 觀察指標(biāo) 體重 各組小鼠在實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)后第4、10、14、