先天性胰膽管合流異常與膽囊癌的關(guān)系

1、    先天性胰膽管合流異常與膽囊癌的關(guān)系        【摘要】目的從細(xì)胞增殖活性的角度了解胰膽管合流異常(AAPB)和膽囊癌的關(guān)系。方法ABC免疫組化法。結(jié)果增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和單克隆抗體Ki-67陽性細(xì)胞在AAPB合并膽囊癌的非癌部(B組)為(9.2±3.8)%，高于不伴AAPB的膽囊癌非癌部D組，(6.6±5.)%，明顯高于單純的慢性膽囊炎組E組，(1.8±1.0%)；另外，不伴有其他膽道疾患的AAPB(C組)的上皮細(xì)胞增殖率(7

2、.4±2.7)%，也明顯高于單純的慢性膽囊炎組。結(jié)論膽囊上皮細(xì)胞增殖活性在有AAPB時(shí)明顯高于無AAPB者，此與慢性膽囊炎的存在無關(guān)。這一增殖活性的增高可能與上皮惡性變密切相關(guān)，AAPB可能是膽囊癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因子?！娟P(guān)鍵詞】胰膽管合流異常；膽囊癌；增殖細(xì)胞核抗原單克隆抗體Ki-67Relationship between gallbladder carcinoma and anomalous arrangement of pancreaticobiliary ductal systemYANG Yang, KANG Shijun, LI Aimin, et al.(Departm

3、ent of Oncology, Nanfang Hospital, the First Military Medical University, Guangzhou 510515)【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between gallbladder carcinoma (GBC) and anomalous arrangement of pancreaticobiliary ductal system (AAPB) through studying the proliferation of gallbladder epi

4、thelial cells. MethodsABC Immunohistochemical staining was employed. Results Ki-67 And proliferating cell nuclear antigen PCNA labeling indexes of the non-cancerous mucosa in the patients with AAPB and GBC were significantly higher than those in patients with GBC alone (P<0.05). Both of the 2 ind

5、exes were significantly higher in patients with AAPB alone than in those with cholecystolithiasis alone and the controls (P<0.01). ConclusionsCell proliferation of gallbladder epithelium is accelerated in patients with AAPB. Therefore, AAPB is an important risk factor for the occurrence of GBC.【K

6、ey words】Anomalous arrangement of pancreaticobiliary ductal system；Gallbladder carcinoma；proliferating cell nuclear antigen；Monoclonal antibody Ki-67臨床經(jīng)驗(yàn)表明，先天性膽總管擴(kuò)張癥(擴(kuò)張癥)病人成年后患膽囊癌的概率很高。隨著影像學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，通過內(nèi)鏡逆行膽胰管造影(ERCP)的應(yīng)用，證明這些擴(kuò)張癥病人多伴有胰膽管合流異常(AAPB)。至此膽囊癌和AAPB的關(guān)系開始變得引人注目1，2。AAPB主要發(fā)生在亞洲，日本最為常見，其次是中國。它是一先天性疾

7、病，主要表現(xiàn)為胰管和膽總管在十二指腸壁外(括約肌之上)結(jié)合，因而胰液很容易返流至膽管，造成膽管擴(kuò)張9。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹荚趶募?xì)胞增殖活性的角度了解AAPB和膽囊癌的關(guān)系。材料與方法1.組織標(biāo)本：收集膽囊石蠟標(biāo)本117例，其中膽囊癌合并AAPB 27例，其癌部為A組，非癌部為B組；無并發(fā)膽囊癌的AAPB 34例(C組)；10例不含AAPB的膽囊癌癌部(D組)；伴膽囊結(jié)石的慢性膽囊炎24例(E組)；22例不伴有任何膽道疾患但在肝癌手術(shù)時(shí)被切除的膽囊作為正常對(duì)照(F組)。2.抗體：第一抗體分別為鼠抗人PCNA單克隆抗體(150稀釋，MBL，Nagoya,Japan)，鼠抗人Ki-67單克隆抗體(MIB-1

8、，1500稀釋，Immunotech SA, Marseilles, France)；ABC試劑盒(按說明書要求使用，Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)。3.ABC法進(jìn)行免疫組化染色：將石蠟標(biāo)本制成23 m厚的連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化。一張用于HE染色，其余用于免疫組化染色。免疫組化染色的切片首先在枸櫞酸緩沖液(0.05 mol/L;pH 6.0)60下處理20 min。在用正常馬血清封閉內(nèi)源性過氧化物酶之后，分別加第一抗體4下過夜第二抗體室溫下1 hABC復(fù)合物室溫下1 hDAB顯色5 min。每一步驟間以PBS洗5 min×3次，最后蘇木素

9、復(fù)染30 s。每組染色有一張切片不加第一抗體，作為陰性對(duì)照，一張淋巴結(jié)切片作為陽性對(duì)照。4.細(xì)胞計(jì)數(shù)：陽性細(xì)胞核染色為棕色。每張切片在200×放大倍數(shù)下隨機(jī)自左向右計(jì)數(shù)1?000個(gè)細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞或上皮細(xì)胞)，算出陽性細(xì)胞占所有被數(shù)細(xì)胞的百分比(陽性細(xì)胞數(shù)÷1?000×100%)。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：6個(gè)組之間陽性細(xì)胞數(shù)的差異以Student t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。P0.05為差異有顯著意義，P0.01為差異有非常顯著意義。結(jié)果1.增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)在各組的陽性率(表1)：對(duì)照組正常膽囊粘膜上皮細(xì)胞陽性率(0.8±0.6)%，所有實(shí)驗(yàn)組的陽性細(xì)胞率均高于對(duì)照，P

10、0.05或0.01。其中AAPB并發(fā)膽囊癌的非癌部組(B組)為(9.2±5.0)%，高于不伴AAPB的膽囊癌非癌部(D組)，(6.6±5.0)%，明顯高于單純的慢性膽囊炎組(E組)，(1.8±1.0)%，說明同樣是膽囊癌，非癌部的細(xì)胞周期在有AAPB時(shí)呈明顯亢進(jìn)狀態(tài)。另外，不伴有其他膽道疾患的AAPB(C組，1)的上皮細(xì)胞增殖率(7.4±2.7)%也明顯高于單純的慢性膽囊炎組。表1PCNA和Ki-67在各膽囊組的表達(dá)分組例數(shù)性別年齡(歲)陽性細(xì)胞率(%)男女PCNAKi-67A2767± 937.5±10.552.0±13.

11、3B2752267± 99.2± 3.8*，*12.3± 5.3*，*C3492551±157.4± 2.7*8.3± 3.0*D1001069± 76.6± 5.09.6± 3.6E24121252±131.8± 1.03.6± 1.8F2214862±100.8± 0.61.1± 0.7* 明顯高于E組，P0.01；* 高于D組，P0.05；* 高于C組，P0.05 2. Ki-67在各組的陽性率(表1)：對(duì)照組為(1.1±0.7)

12、%。AAPB并發(fā)膽囊癌的癌部和非癌部分別為(52.0±13.3)%和(12.3±5.3)%，顯著高于對(duì)照組。而AAPB但無并發(fā)膽囊癌的非癌部(9.6±3.6)%低于AAPB且并發(fā)膽囊癌的非癌部，但高于單純慢性膽囊炎組(3.6±1.8)%和對(duì)照組。3.細(xì)胞周期分析：Ki-67-LI和PCNA-LI之差與Ki-67-LI的比值在含有AAPB的非癌性粘膜上皮(B組和C組)明顯低于不含AAPB的膽囊粘膜上皮(D組和E組)(2)。說明前者S期細(xì)胞的比率較高。4.各組膽囊上皮的組織學(xué)觀察：伴有AAPB的膽囊粘膜上皮經(jīng)常出現(xiàn)腸腺體和杯狀細(xì)胞等腸化生現(xiàn)象、慢性炎癥以及典

13、型的或非典型的增生型改變。B組27例病人中的11例(40%)，靠近腫瘤區(qū)的粘膜由中等到明顯的增生型上皮細(xì)胞組成；相似的組織學(xué)變化在C組34例病人的16例(47%)中發(fā)現(xiàn)。但是在E組和F組，未見以上粘膜改變。在D組10例當(dāng)中有2例接近腫瘤的粘膜呈中等程度的增生。1C組(吻合異常，不伴有膽囊癌)1例病人膽囊粘膜上皮免疫組化染色A.Ki-67染色；B.PCNA染色；陽性細(xì)胞核著色2細(xì)胞周期分析討論Hasumi等3基于對(duì)大量AAPB病人的流行病學(xué)研究，提出AAPB是膽囊癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因子。但其機(jī)理至今尚未明了。盡管一些研究認(rèn)為返流到膽道內(nèi)胰液中的變異原性物質(zhì)是始發(fā)因子4。膽囊上皮細(xì)胞增殖活性的評(píng)價(jià)可

14、以對(duì)AAPB導(dǎo)致膽囊癌發(fā)生提供有用的信息。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)在處于DNA綜合G1后期和S期的增殖細(xì)胞中表達(dá)5，6。Ki-67則反映細(xì)胞周期的全過程，處于DNA合成G1，S，G2，M期的增殖細(xì)胞均表達(dá)Ki-67陽性7，8。本實(shí)驗(yàn)顯示，膽囊上皮PCNA和Ki-67陽性細(xì)胞率在AAPB組(C組)均高于不伴有AAPB的組(E組和F組)。另外，雖然在癌旁非癌區(qū)細(xì)胞增生活性一般較高，但這一部位的細(xì)胞增殖活性在伴有AAPB的膽囊癌(B組)明顯地高于不伴AAPB組(D組)。說明在AAPB時(shí)，膽囊上皮的增生活性明顯亢進(jìn)，并且這不能簡單地以慢性炎癥來解釋。這種高度的、異常性增殖，可以被視為導(dǎo)致上皮癌變的一

15、個(gè)重要原因。Ki-67被認(rèn)為可以識(shí)別細(xì)胞周期中的所有增殖細(xì)胞，而PCNA的表達(dá)于G1晚期開始增加，在S期達(dá)到最高水平。因此，PCNA陽性率總是明顯低于Ki-67。在本研究中，Ki-67-LI和PCNA-LI之差與Ki-67-LI的比值在含有AAPB的非癌性粘膜上皮(B組和C組)明顯低于不含AAPB異常的膽囊粘膜上皮(D組和E組)(2)。說明AAPB時(shí)S期細(xì)胞的比率較高，細(xì)胞的DNA合成功能亢進(jìn)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)伴有和不伴有胰膽管合流異常的病人進(jìn)行PCNA，Ki-67陽性細(xì)胞檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)膽囊上皮細(xì)胞增殖活性在有AAPB時(shí)明顯高于無AAPB者。此與慢性膽囊炎的存在無關(guān)。這一增殖活性的增高與上皮惡性變

16、密切相關(guān)。因此認(rèn)為AAPB可能是膽囊癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因子。致謝：本實(shí)驗(yàn)得到日本山梨醫(yī)科大學(xué)第一外科松本由朗教授、藤井秀樹講師的指導(dǎo)，謹(jǐn)表謝意!楊洋（第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤科廣州市，510515）康世均（第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤科廣州市，510515）李愛民（第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤科廣州市，510515）參考文獻(xiàn)1，Komi N, Takehara J, Kunimoto K. Anomalous arrangement of the pancreaticobiliary ductal system and biliary malignancy. J Gastroenterol Hepato

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