IκBα突變型基因?qū)θ毖跞碧菗p傷永生化神經(jīng)前體細(xì)胞的保護(hù)作用

1、IB突變型基因?qū)θ毖跞碧菗p傷永生化神經(jīng)前體細(xì)胞的保護(hù)作用    畢業(yè)論文 【摘要】 目的 檢測(cè)在缺氧缺糖環(huán)境中，IB突變型基因?qū)τ郎窠?jīng)前體細(xì)胞株（INPCs）NF-B的活性、細(xì)胞存活及細(xì)胞損傷的影響。方法 在建立轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IBM INPCs的基礎(chǔ)上，用MTT法檢測(cè)缺氧缺糖處理3h、6h、9h后兩細(xì)胞株的存活率，用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)兩細(xì)胞株缺氧缺糖6h前后NF-B的活性，并測(cè)定缺氧缺糖6h處理后培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶的含量，用Hoechst33342染色觀察細(xì)胞核的形態(tài)。 結(jié)果 轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM的INPCs 中

2、NF-B的活性均低于轉(zhuǎn)pcDNA3.1的INPCs，缺氧缺糖6h或9h時(shí)，前者存活率高于后者，且6h時(shí)前者上清中的乳酸脫氫酶釋放量較少，缺氧缺糖可使兩細(xì)胞株部分細(xì)胞的核均呈現(xiàn)調(diào)亡改變。 結(jié)論 IB突變型基因可降低INPCs中NF-B的活性，提高INPCs在缺氧缺糖處理后的存活率，減輕細(xì)胞損傷。 【關(guān)鍵詞】干細(xì)胞； NF-B抑制因子； 細(xì)胞缺氧 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30300328） 作者單位：1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉學(xué)教研室 湖北 武漢 430030；2 深圳市第2人民醫(yī)院麻醉科 廣東 深圳 518035 通信作者：張傳漢 02762998989 email：c

3、hzhang 第1作者聯(lián)系電話email：zhchag Mutated IB gene reduce the cell damage of immortalized neural progenitor cell induced by oxygen-glucose deprivation ZHU Chang, LIU Zhi-heng, ZHANG Chuan-han, et al. Department of Anesthesiology，Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of

4、 Science & Technology, Wuhan 430030, China 【Abstract】 Objective To establish the effect of mutated IB gene on immortalized neural progenitor cell strains (INPCs) in oxygen-glucose deprivation. Methods After the establishment of mutated IB gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPC

5、s, the cells were exposed to anoxic/hypoglycemic condition for 3h, 6h or 9h, MTT staining was used to detect the survival rate of the two cell strains. Luciferase assay system was used to detect the activity of NF-B in pcDNA3.1 transfected or pcDNA3.1/IBM transfected INPCs. Lactate dehydrogenase in

6、culture medium was measured after the cells were exposed to anoxic/hypoglycemic condition for 6h. The morphological change of two cell strains was observed by Hoechst 33342 staining. Results The activity of NF-B was down-regulated in pcDNA3.1/IBM transfected INPCs before or after oxygen-glucose depr

7、ivation. The cell survival rate of pcDNA3.1/IBM transfected INPCs was higher than pcDNA3.1 transfected INPCs after the cells was exposed to anoxic/hypoglycemic condition for 6h or 9h.But there was no difference in cell survival rate at 3h. After the cells were exposed to anoxic/hypoglycemic conditio

8、n for 6h, Lactate dehydrogenase content in culture medium was lower in pcDNA3.1/IBM transfected INPCs. Observed by Hoechst 33342 staining, cells were apoptosis after oxygen-glucose deprivation. Conclusion By down-regulated the activity of NF-B mutated IB gene improves the cell survival rate of INPCs

9、 and lessens the cell damage caused by oxygen-glucose deprivation. 【Key words】Stem cells； NF-kappaB inhibitor alpha；Cell hypoxia 本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)IB突變型基因永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株（immortalized neural progenitor cell strain, INPCs）1，并證實(shí)該細(xì)胞株中IB突變型基因可下調(diào)NF-B的活性，使部分炎性細(xì)胞因子的表達(dá)減少。由于NF-B的作用廣泛復(fù)雜，其活性的變化在不同細(xì)胞及不同刺激情況下所引發(fā)的效應(yīng)不同2，下調(diào)NF-

10、B的活性在INPCs中所引發(fā)的效應(yīng)目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬檢測(cè)在正常及缺氧缺糖培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)IB突變型基因及對(duì)照載體的INPCs 細(xì)胞存活及受損的情況，判斷IB突變型基因下調(diào)NF-B的活性后，INPCs對(duì)缺氧缺糖耐受性的變化，為進(jìn)1步探討其可能機(jī)制以及將該細(xì)胞用于移植治療腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎(chǔ)。 材料和方法 材料 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IBM的INPCs由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，NF-B熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒6×B（德國Heike L Pahl教授惠贈(zèng)）。DMEM/F12培養(yǎng)基、B27無血清培養(yǎng)添加劑、脂質(zhì)體lipofectamineTM2000（Gibco公司，美國）；堿

11、性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)（Pepro Tech公司，英國）； MTT、hoechst33342（Sigma公司，美國）；熒光素酶檢測(cè)試劑盒（Promega公司，美國）。 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IBM的INPCs置無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分為：DMEM/F12培養(yǎng)基添加bFGF、EGF各20ng/ml，1×B27，青、鏈霉素各100U/ml，以5×105/ml的密度接種于96孔板，每孔0.1ml，每株細(xì)胞每板接種24孔，共種4板，置37、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，留1板作為對(duì)照組，其余3板作為實(shí)驗(yàn)

12、組，將實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液換為無糖Earles 液后，利用3氣水套式培養(yǎng)箱，充以氮?dú)?，使氧氣濃度維持在3，2氧化碳濃度為5%，分別處理3h、6h及9h，然后將4板的培養(yǎng)液均換為DMEM/F12培養(yǎng)基，加入0.2MTT 50l/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h（37、5%CO2），吸去上清液，加入150l/孔DMSO，震蕩混勻，在酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國）上測(cè)定570nm吸光度值(A570)。以對(duì)照組的細(xì)胞存活率為100%, 以細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)組A570值/對(duì)照組A570值×100%計(jì)算細(xì)胞存活率。 NF-B活性的檢測(cè) 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含有熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒6×B分別轉(zhuǎn)入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA

13、3.1的INPCs及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IBM的INPCs中，48后，1批細(xì)胞置原培養(yǎng)環(huán)境，另1批細(xì)胞按上述缺氧缺糖條件處理6h，根據(jù)Promega公司熒光素酶檢測(cè)試劑盒說明操作，以熒光強(qiáng)度來表示NF-B活性。 乳酸脫氫酶的檢測(cè) 分別將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IBM的INPCs以1×106/孔的密度接種于6孔板，共種2板，接種24h后，1板按上述缺氧缺糖條件處理6h，另1板將培養(yǎng)液換為DMEM/F12培養(yǎng)基，置正常培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)6h，分別取上清，離心除去沉淀后，用全自動(dòng)生化儀測(cè)定上清中乳酸脫氫酶的含量。 細(xì)胞核形態(tài)的觀察 將經(jīng)缺氧缺糖處理6h和正常培養(yǎng)狀態(tài)下的轉(zhuǎn)染pc

14、DNA3.1及pcDNA3.1/IBM的INPCs用甲醇固定15min，加入終濃度5g/ml的Hoechst33342避光反應(yīng)10min，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 12. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示，不同細(xì)胞間比較采用成組t檢驗(yàn)，P < 0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié) 果 細(xì)胞存活率的檢測(cè) 各處理時(shí)點(diǎn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IBM的INPCs存活率見表1，缺氧缺糖3h，兩細(xì)胞株存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，缺氧缺糖6h、9h時(shí)，轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM的INPCs存活率高于轉(zhuǎn)pcDNA3.1的IN

15、PCs，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 NF-B活性的檢測(cè) 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IBM的INPCs常規(guī)培養(yǎng)，NF-B活性分別為：7828±231、1924±185；缺氧缺糖處理6h后，NF-B活性分別為：1101±50，744±27，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 乳酸脫氫酶檢測(cè) 等細(xì)胞密度的轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IBM的INPCs，缺氧缺糖處理6h后，上清中的乳酸脫氫酶分別為391±33 u/L和247±14 u/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 細(xì)胞核形態(tài)的觀察 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcD

16、NA3.1/IBM的INPCs處理前，細(xì)胞核形態(tài)正常，缺氧缺糖處理6h后，有部分細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化等調(diào)亡特征性改變（見圖1），但兩組細(xì)胞呈調(diào)亡改變的細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 討 論 神經(jīng)前體細(xì)胞具有不斷分裂增殖、自我更新以及多分化潛能3，可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)的細(xì)胞來源和外源基因?qū)氲妮d體，在治療腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有著廣泛的應(yīng)用前景。但目前，直接的神經(jīng)前體細(xì)胞移植治療存在細(xì)胞存活有限，以及與宿主細(xì)胞的功能整合不佳等問題4，因此必須著手改善神經(jīng)前體細(xì)胞在移植環(huán)境中的存活及功能。 NF-B是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，在免疫反應(yīng)、炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等方面發(fā)揮多種重要

17、的生理學(xué)功能5。目前，干預(yù)NF-B的活性在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧中所引發(fā)的效應(yīng)研究中，有眾多不同的研究結(jié)果。Duckworth EA等人發(fā)現(xiàn)p50基因敲除鼠的大腦中動(dòng)脈缺血模型中，NF-B的激活減少，神經(jīng)元的死亡明顯較非基因敲除組增多，認(rèn)為大腦中動(dòng)脈缺血時(shí)，NF-B的激活對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用6。而Jatana M等人的研究發(fā)現(xiàn)，大腦局部缺血時(shí)，用5脂氧化酶抑制劑抑制NF-B的激活可起到神經(jīng)保護(hù)作用7。Zhang W等人以特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)的IB突變型基因?yàn)楣ぞ?，發(fā)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈缺血時(shí)，抑制NF-B在神經(jīng)元的激活可減少梗塞面積和神經(jīng)元的調(diào)亡，而抑制膠質(zhì)細(xì)胞中NF-B的激活無明顯作用8。這些研究表明，干預(yù)

18、NF-B活性所產(chǎn)生的效應(yīng)有很強(qiáng)的特異性。 本實(shí)驗(yàn)通過IB突變型基因下調(diào)INPCs中NF-B的活性，提高了轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM的INPCs缺氧缺糖處理6h及9h后的存活率。缺氧缺糖3h、6h及9h，轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM的INPCs細(xì)胞存活率變化不大，可見該細(xì)胞對(duì)缺氧缺糖耐受性較好。同時(shí)缺氧缺糖6h后，轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM的INPCs釋放的乳酸脫氫酶也較少，細(xì)胞受損程度較輕。關(guān)于降低NF-B的活性減少細(xì)胞調(diào)亡的機(jī)制，多數(shù)研究認(rèn)為與抑制NF-B的活性降低了炎性因子的表達(dá)有關(guān)，而在INPCs中的具體機(jī)制目前尚需進(jìn)1步研究。兩細(xì)胞株缺氧缺糖前后進(jìn)行Hoechst33342染色，調(diào)亡細(xì)胞

19、計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與固定過程中部分調(diào)亡的細(xì)胞脫落以及該方法的敏感性不高有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)使用含有熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒6×B檢測(cè)NF-B的活性，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)激活的NF-B能特異性啟動(dòng)熒光素酶的表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量反映了NF-B的活性9，而熒光素酶的表達(dá)量可以通過其催化相同量的底物所發(fā)出的熒光強(qiáng)度來反映。在正常培養(yǎng)狀況及缺氧缺糖處理6h后，轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM的INPCs中NF-B活性均低于轉(zhuǎn)pcDNA3.1的INPCs。在缺氧缺糖后，理論上應(yīng)觀察到NF-B活性的增高，但實(shí)際所測(cè)得的熒光強(qiáng)度低于對(duì)照組，其原因可能是：細(xì)胞的數(shù)量和活性對(duì)熒光素酶的合成有直接影響，

20、在缺氧缺糖處理后，雖然有活性的NF-B增多，可啟動(dòng)熒光素酶的轉(zhuǎn)錄，但能量供應(yīng)障礙使熒光素酶的轉(zhuǎn)錄和翻譯受到抑制，使最終熒光素酶的合成總量減少，所測(cè)得的熒光強(qiáng)度降低。1些實(shí)驗(yàn)者通過共轉(zhuǎn)染以CMV為啟動(dòng)子的-半乳糖苷酶質(zhì)粒，以熒光素酶催化底物所發(fā)出的熒光強(qiáng)度和-半乳糖苷酶催化底物所得產(chǎn)物的光密度值之比來反映不同樣本間NF-B相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性，該方法可校正不同樣本間細(xì)胞數(shù)目及存活狀態(tài)，使實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)謹(jǐn)。 本實(shí)驗(yàn)體外模擬缺氧缺糖環(huán)境，檢測(cè)了轉(zhuǎn)IB突變型基因及對(duì)照載體的INPCs中NF-B的活性、細(xì)胞存活及受損情況，證實(shí)轉(zhuǎn)IB突變型基因通過降低INPCs中NF-B的活性，提高了INPCs在缺血缺氧處理后的存活

21、率，減輕了細(xì)胞損傷。轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM的INPCs在缺血缺氧環(huán)境中有較高的存活率，是進(jìn)1步用于移植治療腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的良好細(xì)胞來源，而存活率提高的機(jī)制和及細(xì)胞移植治療的具體療效尚需進(jìn)1步研究。 參 考 文 獻(xiàn) 1 高峰，田玉科，楊輝，等. 猿腎病毒40大T抗原基因永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株的構(gòu)建J. 中華麻醉學(xué)雜志, 2005,25:597-600. 2 Hoffmann A, Levchenko A, Scott ML, et al. The IkappaB-NF-kappaB signaling module: temporal control and selective

22、gene activationJ. Science, 2002, 298:1241-1245. 3 Galli R, Gritti A, Bonfanti L, et al. Neural stem cell: an overviewJ. Cire Res,2003,92:598-608. 4 Arvidsson A,Collin T,Kirik D, et al. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after strokeJ. Nat Med, 2002, 8(9):963-930. 5 Yenari MA,Han HS. Influence of hypothermia on post-ischemic inflammation: role of nuclear factor kappa B (NFkappaB) J. Neu rochem Int,2006, 49(2):164-169. 6 Duckworth EA,Butler T,Collier L, et al. NF-kappaB prote