MBL基因突變檢測新方法及RRTI患者的突變研究

1、MBL基因突變檢測新方法及RRTI患者的突變研究                          作者：薛麗, 趙新, 楊芳, 趙錦榮, 張文紅, 白玉杰【摘要】  目的：建立一種新的MBL基因突變檢測方法，并分析反復(fù)呼吸道感染兒童中突變頻率及發(fā)病相關(guān)性。方法： PCR擴(kuò)增MBL基因第一外顯子區(qū)段，核酸外切酶和堿性磷酸酶降解, 清除PC

2、R產(chǎn)物中殘余引物和dNTPs，經(jīng)引物延伸反應(yīng)熒光素(R110或TAMRA)標(biāo)記終止堿基特異性摻入引物的3末端，測定熒光偏振值判斷摻入堿基及突變類型。用所建立方法檢測46例反復(fù)呼吸道感染(RRTI)患兒和50例健康對照的MBL突變。結(jié)果：所建立方法檢測MBL突變經(jīng)測序驗證完全正確。在臨床RRTI患兒及對照組中發(fā)現(xiàn)54位密碼子G>A突變，健康兒童中野生純合型(G/G)39例(78.00%)、雜合型(G/A)8例(16.00%)、純合突變(A/A)3例(6.00%);RRTI患兒中野生純合型(G/G)18例(39.13%)、雜合型(G/A)22例(47.83%)、純合突變(A/A)6例(13.

3、04%);RRTI患兒組A等位基因頻率顯著高于對照組?；純汉蛯φ战M均未檢測到52和57位密碼子突變。結(jié)論：MBL 54G>A突變與RRTI發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，所建立的MBL基因多態(tài)性快速檢測方法可用于小兒反復(fù)呼吸道感染輔助診斷和高風(fēng)險人群的篩查。 【關(guān)鍵詞】  甘露聚糖結(jié)合凝集素;基因突變;反復(fù)呼吸道感染;熒光偏振ABSTRACT Objective: To develop a rapid and sensitive method for detecting MBL genetic mutants and evaluate the association with recurrent

4、 respiratory tract infections(RRTI)in children. Methods: The MBL exon1 region was amplified by PCR, the nonincorporated primers and excesses dNTPs were removed by enzymatic digestion. The dyeterminator (R110acyC or TAMRAacyT) was incorporated on the 3end of the primer via template directed dyetermin

5、ator incorporation reaction (TDI) and the mutations were determined by fluorescence polarization (FP) assay. The MBL mutants were analyzed among 50 healthy and 46 RRTI children using this new method. Results: The accuracy and sensitivity were evaluated and verified by standard sequencing method. The

6、 54 G>A mutant was found among both healthy and RRTI children. The genotypes among healthy group were: 39 homozygote wildtype G/G (78.00%), 8 heterozygote G/A (16.00%) and 3 homozygote mutant A/A (6.00%). The genotypes among the RRTI children were: 18 homozygote wildtype G/G (39.13%), 22 heterozy

7、gote G/A (47.83%) and 6 homozygote mutant T/T (13.14%). The frequency of MBL mutation was significant higher in RRTI children than in healthy controls. The 52C>T and 57G>A mutants were not found in both groups. Conclusions: The MBL mutation associates with the risk of RRTI among children. This

8、 new MBL genotype can be used to help the diagnosis and screening the high risk children for RRTI.KEY WORDS Mannanbinding lectin;Genetic mutant; Recurrent respiratory tract infections; Fluorescence polarization甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannanbinding lectin, MBL)是血漿中的膠原凝集素，其多糖識別結(jié)構(gòu)域與細(xì)菌、真菌及寄生蟲等表面的甘露糖或N乙酰氨基葡萄糖結(jié)合，經(jīng)MBL結(jié)合

9、的絲氨酸蛋白酶1和2(MBL associated serine proteases1/2, MASP1/2)激活補體，或介導(dǎo)免疫調(diào)理及炎癥反應(yīng)而激活機(jī)體獲得性免疫反應(yīng)1。研究發(fā)現(xiàn)血漿MBL濃度降低或功能異常導(dǎo)致免疫機(jī)能缺陷，增加多種感染性疾病及自身免疫疾病的發(fā)病風(fēng)險2，3。已發(fā)現(xiàn)MBL基因突變可影響蛋白表達(dá)水平及穩(wěn)定性，降低血漿MBL濃度。檢測MBL基因突變可預(yù)測MBL的基礎(chǔ)水平和機(jī)體的免疫狀態(tài)，不僅能輔助臨床診斷，而且對預(yù)測疾病風(fēng)險及預(yù)防有重要的指導(dǎo)價值。本研究基于模板指導(dǎo)的熒光標(biāo)記終止子摻入反應(yīng)-熒光偏振檢測(template directed dyeterminator incorpo

10、ration with fluorescence polarization, TDIFP)原理，建立快速、簡便的檢測方法，并對46例臨床反復(fù)呼吸道感染(recurrent respiratory tract infections, RRTI)患兒和50例健康兒童進(jìn)行檢測，比較MBL基因突變頻率的差異，發(fā)現(xiàn)MBL突變與RRTI患兒發(fā)病存在關(guān)聯(lián)性。1 材料與方法1.1 基因組DNA提取依據(jù)RRTI診斷標(biāo)準(zhǔn)4 收集RRTI患兒46例，其中男性26例，女性20例，平均年齡4.6歲。健康對照組50例，男性25例，女性25例，平均年齡4.5歲。無菌采集外周靜脈全血，置EDTA鈉抗凝管中，用全血基因組DNA

11、提取試劑盒(TaKaRa大連公司)，參照使用說明書提取基因組DNA。1.2 PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系25L，含10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5L，10mmol/L dNTPs 0.25L，20mmol/L MgCl2 1.25L，DMSO 2.5L，基因組DNA 2L(50100ng)，Taq DNA聚合酶1.5U，10mol/L正反向引物各0.25L。引物序列分別為PF: 5TGTCCCTGTTTTCCATCACTCC3;PR: 5TGCAGAGACAGAACAGCCCAACA3。PCR反應(yīng)條件為：95預(yù)變性5min，94 30s，60 30s，72 30s，共45個循環(huán)，隨后72延伸

12、10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像儀觀察。1.3 TDIFP檢測PCR產(chǎn)物預(yù)處理：采用AcycloPrimerTMFP SNP Detection Kit (PerkinElmer Life Science Co.,美國)所提供試劑并參照其說明書操作。PCR產(chǎn)物分為3組5L，分別加入2L Cleanup混合液(包含蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I)，37溫育1.5h，清除PCR產(chǎn)物中殘留引物和dNTPs，之后80加熱20min滅活消化酶。TDI反應(yīng)：各組消化處理后PCR產(chǎn)物7L，各加入13L AcycloPrimerFP混合液：含10×TDI反應(yīng)緩沖液2L、Ac

13、yclopolTM 聚合酶0.05L、熒光標(biāo)記終止堿基R110acyCTP和TAMRAacyTTP 1L，各加入1L對應(yīng)的突變檢測引物(序列分別為：P52C>T：5CG GCTT CCCAGGCAAAGATGGG3; P54G>A：5GGTTCCCCCTTTTCTCCCTTGGTG3; P57G>A：5CAACACTGACCTGGTTCCCCCTTTCT3)，總反應(yīng)體系為20L。摻入反應(yīng)條件：95預(yù)變性3min，94 15s, 62 30s，共30個循環(huán)。熒光偏振檢測：采用VICTOR2 Multilabel Counter (PerkinElmer Life Science

14、 Co，美國)測定反應(yīng)產(chǎn)物的熒光偏振值，判定摻入熒光標(biāo)記堿基的類型并判讀對應(yīng)的基因型。分別選取TDIFP檢測為突變或野生純合型的PCR產(chǎn)物，常規(guī)分子生物學(xué)操作克隆至T載體pGMTeasy中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌、提取質(zhì)粒、PstI和EcoRI雙酶切鑒定正確后送上海生物工程公司測序驗證TDIFP檢測結(jié)果。驗證正確的質(zhì)粒作為檢測系統(tǒng)的陽性參比標(biāo)準(zhǔn)品。1.4 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析，組間比較采用2檢驗，檢驗水準(zhǔn)=0.05。2 結(jié)果2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)20g/L瓊脂糖凝膠電泳分析顯示為214bp大小的特異性條帶(圖1)，與設(shè)計擴(kuò)增產(chǎn)物相符。M：DNA分子量標(biāo)志D2

15、000; 14: PCR產(chǎn)物;5:空白對照(dH2O取代模版DNA)圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物2.2 TDIFP檢測結(jié)果經(jīng)TDI反應(yīng)熒光標(biāo)記終止堿基R110acyCTP海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報 Vol.16 No.10 Oct.2010或TAMRAacyTTP特異性摻入突變檢測引物的3末端，VICTOR2 Multilabel Counter測定其熒光強度并自動熒光偏振值(mp)，mp升高與熒光標(biāo)記堿基的摻入相對應(yīng)，數(shù)值聚集于4個區(qū)域(圖2)。檢測52C>T采用正向引物，C/C純合子聚集于右下方(R110的mp值高表示摻入R110acyCTP)，T/T純合子聚集于左上方(TAMRA的mp值

16、高表示摻入TAMRAacyTTP)，C/T雜合子聚集于右上方(R110和TAMRA的mp值均高，表示分別摻入R110acyCTP和TAMRAacyTTP)，左下方為陰性對照(無熒光標(biāo)記堿基摻入)。檢測54G>A和57G>A采用反向SNP引物，G/G純合子聚集于右下方，A/A純合子聚集于左上方，G/A雜合子聚集于右上方。依據(jù)所測定各樣本的mp值，儀器內(nèi)置的SNP macro Victor384 V4.0軟件可自動判定其突變和基因型。2.3 臨床標(biāo)本檢測采用所建立的方法分別對46例RRTI患兒和50例健康對照兒童檢測MBL基因突變，兩組中均檢測到密碼子54突變，抽取部分標(biāo)本采用測序法驗

17、證結(jié)果完全一致。A: 52C>T;B: 54G>A; C: 57G>A圖2 TDIFP檢測MBL基因突變RRTI和對照組密碼子54突變分布頻率見表1。等位基因的分布符合HardyWeibery平衡，RRTI組54密碼子突變(A)等位基因頻率(37%)顯著高于對照組(14%)(P<0.05)。兩組中均未檢測到密碼子52和57突變，結(jié)果與先前報道及亞洲人群的分布頻率基本吻合5,6。表1 MBL基因54密碼子基因突變頻率 n(%)3 討論由于獲得性免疫尚未成熟，小兒更多依賴先天免疫系統(tǒng)。MBL在小兒出生前開始表達(dá)，出生后不久即接近成人水平，在先天性免疫中發(fā)揮重要作用。血漿MB

18、L水平及功能與感染、自身免疫等疾病的發(fā)生及嚴(yán)重程度相關(guān)7,8，了解MBL基礎(chǔ)表達(dá)能力及功能對判斷免疫狀態(tài)及病因提供線索，有助于臨床診斷和方案的制定。曾報道采用紅細(xì)胞溶解分析(Haemolytic assays)9和補體激活實驗10測定MBL活性，或用ELISA測定血漿MBL蛋白濃度11。這些技術(shù)首先存在方法上的局限性，紅細(xì)胞溶解測定操作繁瑣，需要純化抗體及紅細(xì)胞等實驗材料;ELISA檢測中抗MBL抗體優(yōu)先選擇性結(jié)合高寡聚體MBL，因而容易低估低寡聚體的濃度。更重要的是血漿MBL水平受多種因素影響，例如在感染或免疫疾病狀態(tài)下，血漿MBL水平可反應(yīng)性升高，此時測定MBL水平不能真實反映個體的基礎(chǔ)水

19、平和免疫能力。從基因組水平分析其遺傳特性，可在一定程度上反映其基礎(chǔ)表達(dá)水平及穩(wěn)定性，更好判斷其基礎(chǔ)免疫狀態(tài)，尤其對于疾病預(yù)測和預(yù)防方面具有更大的價值。1         大約12%25%的個體存在MBL基因突變12,13，某些突變可導(dǎo)致血清總MBL水平降低14,15,免疫功能減弱，增加感染發(fā)病風(fēng)險和嚴(yán)重程度16。例如外顯子1第52密碼子C>T(Arg52Cys)、54密碼子G>A(Gly54Asp)、57密碼子G>A(Gln57Glu)等突變，引起膠原區(qū)域氨基酸置換，干擾蛋白多聚體形成，降低蛋白穩(wěn)

20、定性并加速降解。Hibberd等17對226例英國兒童的研究發(fā)現(xiàn)MBL基因突變與腦膜炎發(fā)病相關(guān)。Nagy等18報道攜帶MBL基因突變兒童衣原體IgG陽性率、反復(fù)感染和哮喘發(fā)病率均顯著高于無基因突變的兒童。在漢族人群中發(fā)現(xiàn)MBL基因突變導(dǎo)致血漿蛋白水平降低，RRTI發(fā)病風(fēng)險增高兩倍5。本研究建立一種新的MBL突變檢測方法，所依據(jù)基本原理是：溶液中熒光分子旋轉(zhuǎn)速度與分子大小呈反比，大的熒光分子旋轉(zhuǎn)速度減慢，其熒光偏振值則升高。設(shè)計3末端緊鄰?fù)蛔兾稽c的檢測引物，TDI反應(yīng)中加入與野生和突變堿基互補的熒光標(biāo)記終止堿基，特異性摻入檢測探針3末端，摻入了終止堿基的檢測引物比游離熒光標(biāo)記堿基分子增大20余倍

21、，熒光偏振值也相應(yīng)增高。通過檢測熒光偏振值可直觀判斷摻入的熒光素標(biāo)記堿基的類型，從而快速確定樣本的基因型。該方法無須分離未結(jié)合游離熒光標(biāo)記堿基，反應(yīng)溶液可直接進(jìn)行檢測，具有操作簡單、靈敏性高、通量高并易于自動化等優(yōu)勢。采用本方法檢測臨床標(biāo)本的MBL基因突變，經(jīng)測序驗證正確。對臨床RRTI患兒的檢測發(fā)現(xiàn)54密碼子G>A突變，發(fā)現(xiàn)RRTI組攜帶MBL突變頻率顯著高于健康對照組，等位基因分布頻率與報道相似19。也表明MBL基因突變與補體免疫功能及反復(fù)感染相關(guān)，支持MBL突變?yōu)镽RTI的遺傳風(fēng)險因子。目前已有用正常人血漿MBL重建MBL缺陷兒童免疫調(diào)理和噬菌功能的嘗試20，也有開發(fā)凝集素類似物作

22、為HIV等藥物的報道21，未來MBL功能調(diào)節(jié)可能成為一種重要的治療策略。通過MBL基因多態(tài)性的快速檢測，推斷MBL水平及補體免疫狀態(tài)，對于發(fā)現(xiàn)小兒反復(fù)感染的病因，以及預(yù)測發(fā)病風(fēng)險具有重要的意義。因而所建立的MBL基因突變檢測方法在指導(dǎo)臨床治療和疾病預(yù)防方面具有應(yīng)用前景?！疚墨I(xiàn)】  1 Takahashi M, Ishida Y, Iwaki D, et al. Essential role of mannosebinding lectinassociated serine protease1 in activation of the complement factor DJ. J E

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27、ring infancy: a prospective birth cohort studyJ. Pediatr Allergy Immunol, 2009, 20(3): 219226.9 Kuipers S, Aerts PC, Sjholm AG, et al. A hemolytic assay for the estimation of functional mannosebinding lectin levels in human serum J. J Immunol Methods, 2002, 268: 149157.10 Suankratay C, Zhang X, Zhang Y, et al. Requirement for the a