AS模型兔主動脈平滑肌與骨骼肌中VLDL受體亞型的分布和表達

1、    【摘要】  極低密度脂蛋白受體（VLDLR）分為兩型，型受體含有胞外O連接糖鏈結(jié)合域，型受體不含O連接糖鏈結(jié)合域。在疾病狀態(tài)下，某些組織中VLDLR亞型分布發(fā)生改變，為了驗證VLDLR亞型分布變化是否與機體脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)，運用RTPCR技術(shù)對VLDLR亞型在動脈硬化（AS）家兔模型組織中的分布和表達進行研究。研究發(fā)現(xiàn)，與正常家兔相比，在AS家兔中，骨骼肌型受體表達略有上調(diào)，主動脈平滑肌型受體上調(diào)幅度比骨骼肌高，但亞型分布并沒有明顯改變。 【關(guān)鍵詞】  極低密度脂蛋白受體（VLDLR）; VLDLR亞型;

2、OLink糖鏈結(jié)合域極低密度脂蛋白受體（VLDLR）1屬于低密度脂蛋白受體（LDLR）超家族2，主要結(jié)合富含ApoE的脂蛋白（VLDL、LDL、LPR、CM、CM殘粒）。該受體廣泛分布于哺乳動物體內(nèi)的各種組織，但不同的組織表達量并不一樣，在甘油三酯活躍的心肌、骨骼肌、脂肪、大腦組織中，VLDL受體的表達較高，其次是腎臟、胎盤、胰腺、肺和大腦，肝臟中表達微量或沒有表達24，說明VLDLR的主要功能是介導組織細胞攝取富含apoE的脂蛋白而參與甘油三酯的代謝5。    VLDLR超家族在結(jié)構(gòu)上的共同特征包括：N端富含半胱氨酸的配體結(jié)合重復序列（Ligandbinding repe

3、ats,LBR），此為配體結(jié)構(gòu)域;表皮生長因子前體同源重復序列；絲氨酸、蘇氨酸副集區(qū)，由第16外顯子編碼，此區(qū)域是受體緊靠胞膜的胞外段，可通過OO連接與炭水化合物連接形成衣被；單鏈跨膜區(qū)；胞內(nèi)區(qū)（具一致性四肽序列AsnProTyr,NPXY的內(nèi)吞信號），每個區(qū)域均負擔特定的功能。該家族成員之間最突出的差異在與LBR的數(shù)目。LDLR含7個LBR，VLDLR含8個LBR68。Yamamato等人對日本大耳白兔各組織的VLDL受體進行研究，發(fā)現(xiàn)VLDLR存在16外顯子剪切變異體，于是根據(jù)VLDL受體胞外段是否含有Olink糖鏈結(jié)合域分為兩種亞型，型受體含有此區(qū)域，型受體不含此區(qū)域。O連接糖鏈域的缺失

4、據(jù)認為是在受體mRNA成熟過程中不同的選擇剪切所致。兩種亞型的VLDLR的組織分布并不一致：型受體主要分布于骨骼肌、心肌、脂肪、腦干等組織中；型受體主要分布于肺、脾臟、腎臟、腎上腺、睪丸、卵巢、子宮、大腦、小腦等組織器官和某些病理條件下的組織細胞中。對兩種受體的功能研究顯示，兩種亞型的VLDLR均可與VLDL、RAR結(jié)合，型受體攝取VLDL的能力與穩(wěn)定性均強于型受體，型VLDL受體胞外段水解脫落的更快，但兩種亞型受體在受體的攝取、內(nèi)吞、胞內(nèi)降解等方面無明顯差別。    本實驗對VLDLR兩種亞型在正常和AS家兔骨骼肌和主動脈平滑肌中的分布進行研究，并進一步探討造成受體亞型表

5、達變化的原因，以期獲得VLDLR亞型表達與分布相關(guān)的資料以及對VLDLR的功能與調(diào)節(jié)的初步研究。1   材料與方法1.1  材料1.1.1  試劑  異硫氰酸胍、DEPC、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、 Oligo d（T）、Taq聚合酶，均購于Promega公司; 氯仿、異丙醇購于上海試劑公司; 水飽和酚購于北京Bioasia公司; dNTP購于TaKaRa公司;膽固醇購于上海試劑公司。1.1.2  實驗標本    正常家兔組織取材：取正常家兔1只，頸動脈放血法處死，打開胸腔，取骨骼肌

6、約1mg。取下主動脈從左心室到膈肌這一段剪下，PBS沖洗去血液，將動脈剪開，用大頭針固定于蠟塊上，用手術(shù)刀輕輕刮表面破壞內(nèi)皮，PBS再次漂洗，用手術(shù)刀輕輕在動脈內(nèi)面劃“井”形切口，用眼科鑷撕下動脈平滑肌層，約1mg。加入變性劑（異硫氰酸胍，十二烷基肌酸鈉，檸檬酸鈉，巰基乙醇）700l，-70冷凍保存。    動脈硬化（AS）模型兔的取材：選取36月齡的健康家兔，建立動脈硬化（AS）模型兔，所用兔飼料為普通干飼料中添加3%甘油三酯和1%膽固醇，在飼料房自制。飼養(yǎng)3個月后，取兔的骨骼肌、主動脈平滑肌層各約1mg，加入變性劑（異硫氰酸胍，十二烷基肌酸鈉，檸檬酸鈉，巰基乙醇）700

7、l，-70冷凍保存。1.2  方法1.2.1  總RNA的提取  取1mg組織，加入700l變性劑，冰浴，勻漿至無明顯組織塊，置冰中5min，加入NaAc（4mmol/L，pH 4.2）70 l，震蕩混勻，冰浴1min；加入等體積酚/氯仿混合物（4：1），震蕩混勻；靜置5 min；4離心12,000rpm 15min; 棄沉淀，移上清液入一新的EP管，加等體積異戊醇沉淀2hr，離心15,000rpm 30 min，可見微黃色的RNA沉淀，溶于適量去離子水中。取1l稀釋250倍，經(jīng)紫外分光光度計分析，如果OD260/OD280>1

8、.9,則表明蛋白質(zhì)雜質(zhì)較少，可用于反轉(zhuǎn)錄。1.2.2  逆轉(zhuǎn)錄反應  每管取總量為1g的RNA溶液, 加入1l  oligo d(T), 加入去離子水至總體積為15l，混勻，70, 5min，后迅速置于冰中冷卻1 min；各管中加入反應混合液11l (MMLV反轉(zhuǎn)錄酶1l(5u), 5×buffer 5l, dNTP 2.5l (4×10mmol/L), 去離子水2.5l ) ，總體積為26l。42, 1hr；72, 15min，終止反應, 放置- 20保存cDNA。1.2.3   PCR 反應

9、  Olink 糖鏈結(jié)合域兩端的引物9位于VLDL受體cDNA的2243bp至2556bp處，編碼VLDL受體胞外段緊靠胞膜富含蘇氨酸/絲氨酸的區(qū)域，型受體的擴增片斷為355bp，型受體的擴增片斷為271bp:    P1 5GCC  ACT  CTA  GTC  AAC  AAC  CT3    P2 5GAA  GTC  CCT  TTT &#

10、160;GGG  GGA  AC3    actin引物的擴增區(qū)域為人類細胞微球蛋白基因的保守區(qū)域，所擴增的片段為316bp:    P1  5TGA  GAC  CTT  CAA  CAC  CCC  AG3    P2 5GCC  ATC  TCT  TGC  TCG

11、0; AAG  TC31.2.4  半定量RTPCR  以actin為內(nèi)參照，以減低擴增片段對擴增效率的影響，actin參照條帶長度為316bp，與糖鏈結(jié)合域的條帶長度近似，所以檢測各組織亞型表達時，將兩種引物進行異管同時擴增，actin引物與糖鏈結(jié)合域引物濃度比為1：1。1.2.5  電泳鑒定與掃描定量  2.5%瓊脂糖凝膠電泳,將凝膠置于紫外分析儀中，用數(shù)碼相機在適宜的曝光時間下拍照，并將照片的數(shù)據(jù)直接輸入計算機中，使用GIS凝膠分析軟件進行不同條帶的峰面積和峰密度掃描定量分析,以

12、峰平均密度代表受體的表達量對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。2  結(jié)果    模型兔以普通飼料添加3%甘油三酯和1%的膽固醇經(jīng)3個月喂養(yǎng)處死，其血漿脂質(zhì)濃度見表1。表1  陰性對照正常兔和AS兔的血漿脂質(zhì)濃度（略）為了檢驗動脈硬化是否對VLDLR的表達量產(chǎn)生影響，將正常家兔和AS家兔各組織進行PCR擴增組織RT產(chǎn)物時，同時加入擴增糖鏈結(jié)合域和actin蛋白的兩對引物進行異管PCR擴增。因actin在細胞中穩(wěn)定表達，將actin條帶平均密度作為VLDLR表達量的內(nèi)參照，以VLDLR條帶與actin條帶平均密度比作為細胞內(nèi)VLDLR的表達平均

13、值。電泳結(jié)果、掃描數(shù)據(jù)及對兩組數(shù)據(jù)進行單因素分析結(jié)果如下：泳道2：正常骨骼??；泳道3、4: AS骨骼??；泳道5：正常骨骼肌actin；泳道6、7： AS骨骼肌actin圖1  泳道1：DNA Marker  PBR322/MSP（略）表2  用Gis對家兔兩種骨骼肌中VLDLR表達量進行掃描（略）泳道1：DNA Marker  PBR322/MSP；泳道2、3：AS主動脈平滑??；泳道4: 正常主動脈平滑??；泳道5、6：AS主動脈平滑肌actin；泳道7：正常主動脈平滑肌actin圖2  正常和A

14、S家兔主動脈平滑肌VLDL受體的半定量PCR結(jié)果表3  用Gis對家兔兩種主動脈平滑肌組織中VLDLR表達量的進行掃描（略）結(jié)果顯示，與正常家兔相比，雖然亞型分布并沒有明顯改變，但在動脈硬化（AS）家兔中，型VLDLR在骨骼肌、主動脈平滑肌中的表達略有上調(diào)，其中主動脈平滑肌上調(diào)約20%，幅度較骨骼肌高，而受體沒有變化。這說明高脂血癥可促進型受體在主動脈平滑肌中的表達，高表達的型受體的意義可能在于促進平滑肌細胞攝取VLDL，導致脂質(zhì)在平滑肌細胞中的堆積，使平滑肌細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎麖亩箘用}粥樣斑塊的形成。3  討論    自從Yamam

15、oto報道VLDLR這兩種亞型以來， VLDLR兩種亞型在各組織中的分布以及分布特點的生理意義成為研究熱點。結(jié)合本實驗室對人體組織中VLDLR各亞型分布的檢測和本實驗對家兔2種組織中VLDLR各亞型分布的檢測，及其它動物體內(nèi)VLDLR亞型分布的報道，可得知VLDLR亞型的分布方式與組織脂代謝水平相關(guān)，脂代謝旺盛的組織主要表達脂質(zhì)攝取功能較強的VLDLR受體亞型。    在AS模型兔的主動脈粥樣斑塊病變中，脂蛋白受體如LDLR、VLDLR、LRP均增高，其中VLDL受體的增高最明顯，有100倍以上10。本實驗室通過對肝硬化病人和糖尿病的病人研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化病人的脾臟、脂肪組織

16、中的型受體表達減少或消失，骨骼肌中的型受體的表達略有增高；糖尿病病人的脂肪組織中，型受體的表達也降低或消失。以上結(jié)果提示機體為了適應內(nèi)環(huán)境的變化可對VLDLR的亞型表達進行調(diào)節(jié)。    高脂血癥不僅使VLDLR表達的量上調(diào)，還可在轉(zhuǎn)錄水平通過選擇性剪切調(diào)節(jié)受體亞型的表達。由于兩種亞型的VLDLR是細胞內(nèi)RNA成熟時的不同剪切所致，在機體細胞中并無兩種亞型的VLDLR基因，高脂血癥引起亞型的變化可能是高脂血癥誘導細胞內(nèi)產(chǎn)生相應的調(diào)節(jié)信號，作用于參與hnRNA剪切的酶類，抑制對16外顯子的切除，主要表達攝取功能較強的型受體，而攝取功能弱較的型受體的mRNA量減少或消失11。&#

17、160;   本實驗的結(jié)果表明，在喂食高脂飼料的中國大耳白兔的主動脈平滑肌與骨骼肌組織中，盡管兔血的各種脂質(zhì)濃度增高，但與陰性正常兔相比，VLDL受體各亞型的分布無明顯變化，這種結(jié)果與細胞模型的結(jié)果不符，可能由于在體內(nèi)的情況下，機體不僅存在脂質(zhì)濃度的提高，激素的分泌也對VLDL受體的表達和亞型產(chǎn)生影響。另外，同時增加的LDL對VLDL受體表達的上調(diào)作用是相對于兩種亞型的VLDL受體均有效，高VLDL對型受體表達的下調(diào)作用被LDL的上調(diào)作用抵消，高脂血癥對型受體的影響在短時期內(nèi)不明顯；也可能是由于VLDL的亞型變化在體內(nèi)的情況下機體的代償能力較強，出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄剪切變化較晚有關(guān)?？傊?，在機體

18、生理功能和機體正常生理環(huán)境紊亂時，VLDL受體的表達量和亞型分布產(chǎn)生復雜的變化，以適應機體的功能的需要。    至今，對VLDL受體亞型分布的變化的研究還鮮有報道。由于VLDL受體在脂代謝中的變化十分明顯，在引起機體代謝紊亂的各種疾病中可作為一個判斷外周組織受病變影響程度的一個輔助指標，但其意義和確定性也待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】  1 Takahashi S, Kawarbayasi Y, Nakai T, et al. Rabbit very low density lipoprotein receptor:a low densitylpoprote

19、in recetorlike protein with distinct ligand specificity. Proc Natl Acad Sci USA , 1992, 89: 9 2529 256.2 Gafvel ME, Caird M, Britt D, et al. Cloning of a cDNA encoding a putative human very low density lipoprotein/apolipoprotein E receptor and assignment of the gene to chromosome 9pterp23. Somat Cel

20、l Mo Genet, 1993, 19: 557569.3 Oliver Tiebel, Kazuhiro O, Kathy R, et al. Mouse very low density lipoprotein receptor(VLDLR):gene syructure,tissue specific expression and dietary and developmental reulation. Atherosclerosis, 1999, 145: 239251.4 Nakamura Y, Yamamoto M, Kumamaru E. Very lowdensity lip

21、oprotein receptor in fetal intestine and gastric adenocarcinoma cells. Arch Pathol Lab Med，2000，124: 1 1191 122.5 Gafveels M, Paavola L, G,Boyd C, et al. Cloning of a complementary deoxyribonucleic acid encoding the murinehomolog of the very lowdensity lipoprotein/ apolipoprotein E receptor:expressi

22、on pattern and assignment of the gene to mouse chromosome19. Endocrinology, 1994, 135: 384394.6 Bujo H, Yamamoto T, VLDL receptor in health and disease:interview with a receptorin avian oocytes and mammalian muscle and fat cells. Atheroscler Thromb, 1996, 2(2): 7175. 7 Jingami H, Yamamoto T, The VLDL receptop: wayward brother of the LDLfamily. Curr Opin Lipido, 1995, 48: 104108.8 Yamamoto T, Hoshino A, Taahashi S, et al. The role of the very low density lipoprotein receptor in t