基因表達(dá)量實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)步驟

1、基因表達(dá)量實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)步驟1 材料（試劑和耗材）1.1 樣本（小鼠組織）-2個(gè)1.2 引物（life technology公司合成）1.3 BestarTMqPCR RT Kit（德國(guó)DBI貨號(hào)：DBI-2220）1.4 Bestar® SybrGreenqPCRmastermix（德國(guó)DBI貨號(hào)：DBI-2043）1.5 96孔板（美國(guó)life technology）2 材料（儀器）2.1 ABI7500熒光定量PCR儀（life technology公司）2.2 TGL-16M低溫冷凍離心機(jī)（湘儀）2.3 SW-CJ-1D單人凈化工作臺(tái)（瀘凈凈化）2.4 HR40- A

2、2生物安全柜（Haier）3 實(shí)驗(yàn)步驟3.1 RNA的抽提RNA 的提取按life technology公司提供的Triozol RNA提取試劑盒的使用說明進(jìn)行。程序如下：（1）將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml TRIzol；（2）加入0.2mL氯仿，蓋緊離心管管蓋，上下顛倒混勻60s（請(qǐng)勿渦漩激烈振蕩），室溫靜置3min，12,000g，4離心 15min，置于冰上；（3）溶液分為三層，RNA溶解在水相中，小心吸取 500l水相至另一個(gè)新的RNasefree的EP管中；（4）加入500l異丙醇，-20度放置1h，12,000g，4離心10min，離心后管底出現(xiàn)RNA沉淀，

3、棄上清；（5）加入1ml 75乙醇，用手輕輕顛倒，12,000g離心5min，去上清；（6）超凈工作臺(tái)上吹干樣品10min，加入適量DEPC水溶解RNA。加入40l DEPC水溶解沉淀。3.2 RNA質(zhì)量檢測(cè)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度：3.3去基因組DNA和cDNA的合成將RNA加入到gDNA吸附柱，室溫10,000g離心1min，收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。把RNA在65°C條件下熱變性5分鐘后，立即置于冰上冷卻。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：5×RT BufferRT Enzyme MixPrimer MixRNARNase-free WaterToal反應(yīng)條件：37

4、6;C, 15min98°C, 5min4°C,hold反應(yīng)結(jié)束后，-20°C保存。 2L 0.5L 0.5L 6L 1L 10L3.4cDNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 3.4.1實(shí)驗(yàn)步驟每個(gè)樣本分別設(shè)置3個(gè)目的基因和3個(gè)內(nèi)參基因的平行實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系為20L，根據(jù)表1.配置。反應(yīng)條件為：95°C2min 95°C10s60°C34s（采集熒光信號(hào)） 72°C 30s循環(huán)結(jié)束后從60升高到98獲取熔解曲線。45個(gè)循環(huán)3.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析方法本實(shí)驗(yàn)采用2-Ct法進(jìn)行分析，計(jì)算公式為：F=2對(duì)照組目的基因?qū)φ战M管家基因待測(cè)組目的基因待測(cè)組管家基因-（ - ） -（ - ）平均Ct值平均Ct值平均Ct值平均Ct值F為相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)此次試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，對(duì)照組中的目的基因表達(dá)量為1。4結(jié)果4.1 擴(kuò)增曲線4.2 熔解曲線4.3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見EXCEL表格。備注：Ct