動物細(xì)胞染色體熒光原位雜交

1、實驗22 動物細(xì)胞染色體熒光原位雜交實驗?zāi)康?使學(xué)生掌握染色體熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH 分析技術(shù),了解染色體熒光原位雜交分析技術(shù)的應(yīng)用價值。實驗原理:FISH(fluorescence in situ hybridization技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù),其基本原理是利用被檢測的染色體上的靶DNA與所用的核酸探針(probes間的序列同源互補性,經(jīng)“變性退火復(fù)性”,形成靶DNA與核酸探針的雜交體(圖22-1。核酸探針既可以直接用熒光分子標(biāo)記,也可以在先標(biāo)記上報告分子如生物素、地高辛,再使報告分子與熒光素標(biāo)記的特異親

2、和素或抗體發(fā)生免疫化學(xué)反應(yīng),最后經(jīng)熒光顯微鏡對靶DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析(圖22-2。 FISH是目前進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)研究最為有效的手段,不僅可以研究分析染色體減數(shù)分裂過程的行為和不同基因組染色體交叉互換的現(xiàn)象,也是研究基因組分化的重要工具,甚至可以篩選出染色體標(biāo)記的種特異性重復(fù)序列。FISH為研究染色體上DNA的序列提供了一個最直接的方法。具有經(jīng)濟(jì)、安全、快速、穩(wěn)定,靈敏度高等優(yōu)點。FISH中使用的探針有:(1基因組探針(genomic probe:人類基因組內(nèi)一些高頻率的重復(fù)序列,在進(jìn)化上很少具有保守性。若以基因組DNA作為探針,這些存在于探針和靶細(xì)胞DNA序列中的高度重復(fù)序列之間

3、會首先退火結(jié)合,越過那些保守的和單一的序列,故雜交會呈現(xiàn)出種特異性?；蚪M重復(fù)序列包括:著絲點重復(fù)(Centromere repeats 、端粒重復(fù)(Telomere repeats、核糖體DNA(Ribosomal DNA,rDNA、Interspersed repetitive elements (SINEs, LINEs等(圖22-3、4。(2染色體特異性序列探針(probe recognizing chromosome specific sequences:目前在人幾乎所有染色體中已經(jīng)克隆出一些重復(fù)序列,重復(fù)一百到五千次不等,各具染色體特異性。大多在某一染色體的著絲粒區(qū)或異染色質(zhì)區(qū)產(chǎn)生

4、致密的雜交帶。從而可特異性地識別某一染色體(圖22-5。(3染色體文庫探針(chromosome labraries probe:染色體文庫收集人類單條染色體的DNA作為探針,又稱整體染色體探針。單條染色體的獲得一般有兩種方法:來自僅攜有某一條人類染色體的體細(xì)胞雜交株,或經(jīng)流式細(xì)胞分類儀從染色體懸液中分離。(4單一序列探針(single-copy sequences probe:FISH有一弱點,就是要求探針足夠大,探針越小,雜交位點檢出率就越低。欲利用FISH檢測存在基因組內(nèi)的單一序列基因,最有效的方法是應(yīng)用含大插入片段的克隆載體,如全Cosmids(載約40kb的插入片段,更大的YAC載體

5、(載100-800kb插入片段。若掌握好,小到2kb的質(zhì)粒探針亦可用FISH方法定位,但效率較低(圖22-6。 24色mFISH(Multicolor FISH核型分析技術(shù)是近年建立的一種新技術(shù)。其原理是使用5種熒光染料按比例標(biāo)記探針,雜交后形成24條染色體各自呈現(xiàn)特異的熒光色彩以供核型分析(圖22-7,8。為研究人員提供了更豐富詳盡的細(xì)胞遺傳學(xué)信息,包括確定標(biāo)記染色體的來源、檢測微小的染色體易位和檢測復(fù)雜的染色體易位,尤其為腫瘤細(xì)胞染色體分析提供了全新、高效的方法。FISH的應(yīng)用領(lǐng)域有: (1基因定位與基因制圖(gene mapping。FISH已經(jīng)極大地加速了人類基因定位和基因制圖的進(jìn)程。

6、(2基因診斷(gene diagnosis。精確、直觀、明了;(3間期細(xì)胞遺傳學(xué)(interphase cytogenetics;(4FISH在腫瘤生物學(xué)中的應(yīng)用:腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)(onco-cytogenetics;基因定位:FISH可用于分離出的癌基因與抑癌基因初步定位;病毒基因插入基因組部分的檢測。利用FISH可以檢測到病毒整合到人基因組中的情況,對深入研究病毒致癌機(jī)理,以及檢測、防治腫瘤均具有重要意義;基因的擴(kuò)增與缺失:原癌基因的激活與抑癌基因的失活是目前腫瘤研究的熱點。已知原癌基因的激活方式有:突變、基因擴(kuò)增、易位、病毒序列插入。抑癌基因的失活方式有:點突變、基因缺失。FISH為研究基

7、因的擴(kuò)增和缺失提供了新的方法,能將基因擴(kuò)增和染色體重復(fù)分開。 圖22-4 FISH with repetitive probes to human chromosomes. 圖22-5 Human chromosome 1 圖22-6 特異位點定位BAC FISH。 實驗試劑:1.-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES2.細(xì)胞的培養(yǎng)、秋水仙素處理、低滲及固定處理試劑同實驗27。3.端粒DNA檢測探針:5-FITC-CCCTAACCCTAACCCTAA-3;FITC的激發(fā)波長為494nm和發(fā)射波長518nm。探針在合成時,同時進(jìn)行5末端的生物素(biotin、或地高辛(DIG、或熒光標(biāo)記(如FITC

8、、Cy3等標(biāo)記。注意: DNA探針標(biāo)記物熒光檢測的熒光分子激發(fā)和發(fā)射波長不能和復(fù)染液中DAPI染料的激發(fā)和發(fā)射波長重疊,應(yīng)有較大差值,避免相互干擾。4.鮭魚精DNA(Salmon Sperm DNA:超聲打碎。5.20×SSC(pH7.0:3M NaCl,0.3M 檸檬酸鈉(sodium citrate,NaOH 調(diào)pH為7.0,高壓滅菌,室溫保存。6.甲酰胺(formamyde(去離子,pure7.50% 硫酸葡萄糖(Dextran Solfate8.250mM 磷酸鈉(sodium phosphate(pH7.09.Hybridization buffer:50% deioniz

9、ed formamide, 2×SSC, 50 mM sodium phosphate(pH 7.0, 5% dextran sulfate, and 3 ng/ml probe.10.變性液A:70%甲酰胺,2×SSC,用1M HCl調(diào)pH到7.0,加入50mM 磷酸鈉以維持pH。11.漂洗液A:30%50%甲酰胺,2×SSC;用1M HCl調(diào)pH到7.0。12.漂洗液B:0.11×SSC;用1M HCl調(diào)pH到7.0。13.漂洗液C:2×SSC,0.1% Tween20;用1M HCl調(diào)pH到7.0。14.封閉液:5% BSA或脫脂奶粉,4

10、×SSC15.復(fù)染液:2×SSC,0.1% Tween20,200ng/ml DAPI。也可以使用10 ng/ml碘化丙錠(PI或Hoechst33258(500ng/ml。DAPI,即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole。DAPI是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料。和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光。和EB (ethidium bromide 相比,對雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。DAPI的最大激發(fā)波長為340nm,最大發(fā)射波長為488nm;DAPI和雙鏈DNA結(jié)合后,最大激發(fā)

11、波長為364nm,最大發(fā)射波長為454nm。 DAPI溶液用水配制。用于細(xì)胞核染色時,推薦的DAPI工作濃度為0.5-10g/ml。Hoechst 33258,也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258。Hoechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料,對細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33258染色常用于細(xì)胞凋亡檢測,染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。Hoechst 33258也常用于普通的細(xì)胞核染色,或常規(guī)的DNA染色。Hoechst 33258的最大激發(fā)波長為346nm,最大發(fā)射波長為460nm;Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后,最大激

12、發(fā)波長為352nm,最大發(fā)射波長為461nm。Hoechst 33258溶于水,溶解度可達(dá)10mg/ml。用于細(xì)胞核染色時,推薦的Hoechst 33258工作濃度為0.510g/ml。16.封片液:2.5% DABOCO或1%鄰苯胺二鹽酸,200mM Tris-HCl, pH8.6, 90%甘油。17.coplin jar:實驗步驟:1.從體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞準(zhǔn)備的中期染色體標(biāo)本:A.細(xì)胞的培養(yǎng)、秋水仙素處理、低滲處理、固定處理同實驗21。B.載玻片用硫酸洗液浸泡過夜,清洗烘干,在5% APTES-乙醇溶液中60處理2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 3h，取出清洗，70干燥備用。 C.

13、 將固定后的細(xì)胞滴于 APTES 修飾的載玻片上, 空氣干燥。 D. 脫水：70%、90%和 100%乙醇脫水，每次 5 min，空氣干燥。注意：室溫下玻 片標(biāo)本可保存數(shù)天到數(shù)周；若載玻片要長期保存，應(yīng)在室溫下過夜使組織“老 化” （aged） ，然后放入容器中，該容器密封于含干燥劑的塑料袋內(nèi)，-70保 存。-20保存的玻片可在 6 個月內(nèi)使用；-70可保存一年以上；但標(biāo)本一旦 溶化，則不能在此冷凍。 染色體標(biāo)本變性及脫水： A. 載玻片靜置 60烤箱孵育預(yù)熱。 B. 變性液 A 在水浴中加熱至 70。 C. 將染色體標(biāo)本載玻片浸入變性液 A 中，70作用 2min。 D. 脫水： 立即將載玻

14、片依次移入冰冷的 70、 90及 100乙醇中， 各保持 5min。 空氣干燥玻片。 探針雜交液的準(zhǔn)備（10l/片） ： A. 1020ng 探針 DNA 和 13g 鮭魚精 DNA 混合，熱塊干燥 DNA。 B. DNA 中加入 67l 甲酰胺，懸浮 DNA， 保持 30min。 C. DNA 溶液中加入 1l 20×SSC （終濃度 2×SSC） 、2l 硫酸葡萄糖（終濃度 10%） 、1l 250mM 磷酸鈉（終濃度 25mM） 。保持 30min。 D. 75變性 DNA 探針 5min。 染色體標(biāo)本的雜交： A. 將 10l 含變性探針的雜交液加至載玻片的變性靶

15、DNA 上。 B. 在雜交液液滴上小心地蓋上 18×18cm 的蓋玻片，避免壓入氣泡。 C. 載玻片置于濕盒內(nèi)，37溫育過夜。 D. 雜交結(jié)束前，42水浴預(yù)熱漂洗液 A，60水浴預(yù)熱漂洗液 B。 E. 載玻片移入 42預(yù)熱的漂洗液 A 中， 42水浴中振蕩 10min 直至蓋玻片脫 在 落。 F. 載玻片移入另一份 42預(yù)熱的漂洗液 A 中，振蕩 5min，更換漂洗液 A 兩次， 每次振蕩 5min。 G. 載玻片移入含 60預(yù)熱的漂洗液 B 中，漂洗 5min，更換漂洗液兩次，每次漂 洗 5min。 若 DNA 探針用熒光標(biāo)記， 則無需進(jìn)行下列檢測步驟， 可直接進(jìn)行顯微鏡熒光觀察。

16、 染色體標(biāo)本的檢測： A. 載玻片滴加 50200l 封閉液，22×40mm 蓋玻片覆蓋，置濕盒內(nèi)，37溫育 至少 30min。取出載玻片，無菌水輕輕沖去蓋玻片。 B. 用封閉液配制的檢測化合物溶液（120g/ml） 。如熒光素偶聯(lián)的鏈親和素 （streptavidin） ，或抗地高辛抗體（Anti-DIG-fluorescent-conjugate）溶液。 C. 載玻片上滴加 50l 含熒光標(biāo)記分子的檢測液，22×40mm 蓋玻片覆蓋，置濕 盒內(nèi)， 37溫育 30min，或室溫放置 1h。 D. 取出載玻片，無菌水輕輕沖去蓋玻片；將載玻片移入漂洗液 C 中，42振蕩 漂洗

17、 3 次，每次 5min。 將載玻片置入含復(fù)染液中，室溫振蕩 20min。 將載玻片移入漂洗液 C 中，室溫溫育 12min。 載玻片上滴加 1050l 甘油封片液，22×40mm 蓋玻片覆蓋，用潔凈指甲油封閉玻 片。玻片在-20或-70暗處保存數(shù)天或數(shù)月。 注意事項： 1. 進(jìn)行熒光物質(zhì)的實驗步驟時，采取避光措施。 2. DAPI 對人體有一定刺激性，請注意適當(dāng)防護(hù)。 3. 原位雜交最好使用易透過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)或核內(nèi)的寡核苷酸探針和短的 PCR 標(biāo)記 探針（80150bp） 。 4. 原位雜交中，無論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為 0.55.0g/ml。 5. 最適復(fù)性溫度（Opti

18、munm renaturation temperature, TOR） ：TOR=Tm25。 6. 苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm (10 或 15 7. 非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm (30 或 35 參考文獻(xiàn)： Fluorescence in situ hybridization. Nature Methods 2005, 2(3: 237-238 示例圖片： In situ hybridization of a-satellite probes to human chromosomes 1, 15 and 17 detected by tyramide signal amplificat

19、ion. a-Satellite probes to chromosomes 1, 15 and 17 were labeled by nick translation with biotin-11-dUTP, Texas Red-12-dUTP and Oregon Green 488-5-dUTP, respectively. Following simul¬taneous hybrid¬ization of all three probes, the biotin¬ylated chromosome 1 probe was detected with HRPstreptavidin conjugate and Alexa Fluor 546 tyramide. HRP activity from this first TSA detection step was then quench