當歸注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷后PTEN的表達及統(tǒng)計分析

1、         11-06-01 09:41:00     作者：葉皓    編輯：studa20【摘要】  目的：探討當歸注射液對缺血再灌注損傷心肌細胞PTEN的表達及統(tǒng)計學意義。方法:將35只SD大鼠隨機分成4組(n=10):正常對照組(n=5);假手術組(n=10);缺血再灌注組(n=10);當歸治療組(n=10) ,建立在體心肌缺血再灌注動物模型。實驗完畢后，將各組動物心肌組織做免疫組織化學染色;觀察各組動物心肌細胞

2、內PTEN表達的變化。利用HPIAS2000圖像分析系統(tǒng)測定PTEN在以上各組中表達的平均光密度和平均陽性面積率。結果：正常對照組：心肌細胞內可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達呈陰性;假手術組：心肌細胞內可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達呈陰性;缺血再灌注損傷組：心肌細胞內可見大量的棕黃色顆粒沉積，PTEN表達呈陽性;當歸治療組：心肌細胞內可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達呈陰性。圖像分析結果顯示：正常對照組、當歸治療組、 假手術組與缺血再灌注損傷組之間PTEN表達的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01);正常對照組與假手術組之間、當歸治療組與假手術組之間P

3、TEN表達的平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0.05)。結論：當歸注射液對大鼠缺血再灌注損傷導致心肌細胞的凋亡有重要的保護作用。 【關鍵詞】  當歸注射液; 缺血再灌注; 心肌; 細胞凋亡; PTEN心肌缺血再灌注損傷( ischemia / reperfusion, I/R), 是指在短時間心肌血供中斷, 一定時間內恢復血供, 原缺血心肌發(fā)生較血供恢復前更嚴重的損傷。隨著心臟外科體外循環(huán)、冠狀動脈搭橋術、復雜先天性心臟病糾治術、及溶栓等治療的推廣應用, 已成為阻礙心血管治療療效的主要難題1。近年,中草藥在心肌缺血再灌注損傷中的作用受到越來越多的關注, 中草藥舒張

4、冠狀血管、改善冠脈循環(huán), 減輕氧化損傷等均是其發(fā)揮心臟保護作用的重要機制2。當歸為傘形科(Umbrelliferae)植物的干燥塊根,藥性甘、辛、溫,入肝、心、脾經, 具有補血活血、調經止痛、潤燥滑腸等功效3，4。當歸屬于和血類藥物(指有養(yǎng)血、調和血脈作用的藥物) 。近年來，有不少學者對中藥預處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用進行了研究與探索。PTEN 基因是迄今為止發(fā)現的第一個具有雙特異性磷酸酶(DPS) 活性的抑癌基因,該基因在細胞的生長、增殖、遷移和細胞凋亡中具有重要的生物學功能5。本實驗采用免疫組織化學方法觀察當歸注射液對缺血/再灌注過程心肌細胞內PTEN的表達,探討當歸注射液對心肌缺

5、血/再灌注損傷的作用機理。1 材料與方法1.1 材料1.2 主要試劑25%當歸注射液(武漢大學中南醫(yī)院制藥廠);即用型兔抗鼠Bim多克隆抗體，即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒，DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸。以上試劑均購于北京中山生物技術有限公司。1.3 方法P法檢測PTEN相關抗原 主要步驟：5m組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫處理10 min以抑制內源性過氧化物酶活性，Ki67均采用高壓抗原修復，正常羊血清處理10 min以減少非特異性背景，一抗4孵育過夜，生物素標記的二抗處理10 min，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物處理10min，DAB顯色液顯色，自來水沖洗終止反應，蘇木精復

6、染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照組。1.4 免疫組織化學結果判斷PTEN以胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應。陰性對照組除細胞核染成藍色外，應無棕黃色反應物。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)對PTEN抗原的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×400)，測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。1.5 統(tǒng)計學處理對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和q 檢驗，檢驗水準為0.05。2 結果PTEN的表達

7、 正常對照組：心肌細胞內可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達呈陰性;假手術組：心肌細胞內可見少量棕黃色顆粒，PTEN表達呈陰性;缺血再灌注損傷組：心肌細胞內可見大量的棕黃色顆粒沉積，PTEN表達呈陽性;當歸治療組：心肌細胞內可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達呈陰性。圖像分析結果顯示：正常對照組：PTEN表達的平均光密度為0.1925±0.0011，假手術組：PTEN表達的平均光密度為0.2013±0.0024，缺血再灌注損傷組：PTEN表達的平均光密度為0.8974±0.0086;當歸治療組：PTEN表達的表達的平均光密度為0.2183±0.003

8、8;正常對照組：PTEN表達的陽性面積率為0.2038±0.0023，假手術組：PTEN表達的陽性面積率為0.2159±0.0026，缺血再灌注損傷組：PTEN表達的陽性面積率為0.9631±0.0077;當歸治療組：PTEN表達的表達的陽性面積率為0.2485±0.0048。經單因素方差分析，各組間的差異有顯著性意義(P<0.05)。經q 檢驗，正常對照組、當歸治療組、 假手術組與缺血再灌注損傷組之間PTEN的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01);正常對照組與假手術組之間、當歸治療組與假手術組之間PTEN平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P&