醇沉4組分蘆薈多糖通過不同給藥途徑對(duì)SD大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合過程中纖維連接蛋白含量的影響

1、醇沉4組分蘆薈多糖通過不同給藥途徑對(duì)SD大鼠深口度燙傷創(chuàng)面愈合過程中纖維連接蛋白含量的影響摘要目的 研究醇沉4組分蘆薈多糖對(duì)SD大鼠深H 度燙傷創(chuàng)面修復(fù)過程中皮膚愈合率及皮膚組織中纖維連接 蛋白(FN)含量的影響，探討蘆薈多糖促進(jìn)燙傷創(chuàng)面愈合的 可能作用機(jī)制。 方法 大鼠背部用水浴烙鐵法致傷，采用隨 機(jī)數(shù)字表法對(duì)大鼠分組。 試驗(yàn)組用醇沉 4 組分( 60%、70%、 80%、 90%比例)蘆薈多糖水溶液采取外敷、灌胃及混合給 藥3種方式，對(duì)照組用生理鹽水采取相同給藥方式，2次/d。記錄傷后 3、7、14 d 創(chuàng)面愈合率，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA測(cè)定創(chuàng)面皮膚組織中FN含量。 結(jié)果 與對(duì)照

2、組比較，試驗(yàn)組愈合率明顯升高，80%、 90%蘆薈多糖組于燙傷后14 d?面愈合率明顯高于對(duì)照組(P關(guān)鍵詞 蘆薈多糖； 醇沉；給藥途徑； 燙傷創(chuàng)面； 愈合； 纖維連接蛋白；含量中圖分類號(hào) R644 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1673-7210 ( 2017) 04( b) -0022-04Abstract Objective To study the effects of aloe polysaccharide in four components of alcohol precipitation on the healing rate of skin and the contents of

3、fibronectin( FN)during healing process in SD rats with scalded wound surface ofdeep n degree, and to investigate the possible mechanism of aloe polysaccharide in promoting the healing of scalded wound surface. Methods The back of rats was injured by iron in boiling water ， and the rats were grouped

4、by random digits table. Experimental group was applied with aloe polysaccharide aqueous solution in four components of alcohol precipitation （60%， 70%，80% and 90%）， with 3 administration routesof external application ， gastrogavage and mixing administer ； control group was applied with physiological

5、 saline by the same administration routes ， twice a day. The healing rate of wound surface was recorded after scalding for 3 ，7，14 d， and thecontent of FN in wound surface was determined by enzyme linked immunosorbent assay （ ELISA）. Results Compared with control group ， the healing rate in experime

6、ntal group was increased significantly ， and the healing rates in 80%，90%aloe polysaccharide groups after scalding for 14 d were significantly higher than that of control group（PKeywords Aloe polysaccharide ； Alcohol precipitation ； Administration routes ； Scalded wound surface； Healing； Fibronectin

7、 ； Content開發(fā)既能消炎止痛、抗感染、促進(jìn)創(chuàng)面愈合且愈后瘢痕 少，又經(jīng)濟(jì)便宜、操作方便的外用藥物，成為目前臨床上燒燙傷創(chuàng)面治療的重點(diǎn)。蘆薈是多年生百合科肉質(zhì)草本植物， 具有良好的抗炎 1 、抗氧自由基 2 、調(diào)節(jié)免疫 3 、促進(jìn)創(chuàng)傷 愈合 4 、抗細(xì)菌 5 、抗真菌 6 、抗病毒 7及抗輻射 8、抗 癌9等作用，廣泛用于治療燒燙傷、創(chuàng)傷。蘆薈多糖為主要 生物活性成分，可刺激免疫，激活巨嗜細(xì)胞產(chǎn)生10 ，分泌多種細(xì)胞因子如表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 核因子等 11 ；促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖并影響受損內(nèi)皮細(xì) 胞修復(fù)12，促進(jìn)傷口愈合。研究發(fā)現(xiàn)蘆薈凝膠對(duì)口度燙傷 大鼠具有促進(jìn)創(chuàng)面

8、愈合和減少瘢痕形成的作用 13 。本研究 通過建立大鼠深口度燙傷模型，按鮮榨汁法制備庫(kù)拉索蘆薈 凝膠中醇沉 4 組分蘆薈多糖水溶液采取外敷、灌胃及混合給 藥 3 種方式，觀察大鼠燙傷創(chuàng)面愈合率及皮膚組織中纖維連 接蛋白（FN）含量，探討蘆薈多糖促進(jìn)燙傷創(chuàng)面愈合的作用 機(jī)制，為蘆薈多糖制劑在燒燙傷方面臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠450只，成年（12月齡），雌雄各半，體 重（200 20）g，由桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物室提供 （桂 動(dòng)字第P0020500A?）。嚴(yán)格遵循科技部關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 的指導(dǎo)性意見 ，經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí) 施。1.2

9、 藥品與試劑蘆薈多糖，采用百合科蘆薈屬植物庫(kù)拉索蘆薈去皮取肉 質(zhì)部分按鮮榨汁法提取，醇沉法制備。庫(kù)拉索蘆薈品種來源 于桂林醫(yī)學(xué)院藥用植物園，經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院生藥教研室唐愛蓮 教授鑒定為正品。大鼠 FN酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA試劑 盒（SBJ 96T, PD-7002）購(gòu)自南京安培化工科技有限公司。1.3 儀器電子天平（HK-7532,瑞士 Mettler公司）；振蕩器（B0025, 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；組織粉碎機(jī)（JB90-D,上海標(biāo)本模型 廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（C0034,上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；快速恒 溫?cái)?shù)顯水浴箱（JK-56,常州國(guó)華儀器廠）；-80C超低溫冰箱（M-6200 ,日本Sany

10、o公司）；自動(dòng)高速低溫離心機(jī) （J6-HC, 美國(guó)Beckman公司）；酶標(biāo)儀（K-6010,美國(guó)Bio-Tek公司）。1.4 方法1.4.1 蘆薈多糖水溶液制備鮮榨汁法 14 制備蘆薈凝膠。取新鮮庫(kù)拉索蘆薈葉，洗 凈瀝干剪成長(zhǎng)條狀并去皮，取葉肉用組織粉碎機(jī)打成膠狀， 稱定質(zhì)量，將蘆薈凝膠置于燒杯中加 3 倍量蒸餾水， 0.5%活 性炭脫色，超聲30 min后60 C水浴30 min , 6層紗布過濾后 減壓抽濾。濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積1/5，加0.2%0.5%抗氧化劑 Na2SO3防止氧化。運(yùn)用醇沉法 15 按 60%、70%、80%、90%比例提取蘆薈 凝膠中的蘆薈多糖。將制備好的

11、新鮮蘆薈凝膠各 4份， 3倍量蒸餾水于60C水浴30 min充分溶解，減壓抽濾，濾液分 別用無水乙醇配成料液比為1 : 1.50、1 : 2.33、1 : 4.00、1 :9.00 的蘆薈凝膠 -乙醇混合溶液， 靜置過夜， 得白色絮狀沉淀。 傾去上清液，取下層混合液于60 C水浴蒸干，將所得物質(zhì)再 次加水復(fù)溶，重復(fù)操作，研磨得到白色均勻細(xì)膩的粉末，即 醇沉 4 組分的蘆薈多糖， 蒸餾水溶解配制成濃度為 10 mg/mL 蘆薈多糖水溶液，冷藏備用。1.4.2 大鼠燙傷模型建立大鼠腹腔麻醉， 背部脫毛消毒， 將開水浴中煮沸鐵棒 （橫 斷面1.5 cm X 1.0 cm） 端緊貼大鼠背部皮膚持續(xù)7

12、s,造成約10%面積燙傷，創(chuàng)面病理證實(shí)為深度，腹腔注射乳酸林 格液 5 mL 抗休克。因背部燙傷部位大鼠未能舔食觸及和搔抓， 故將燙傷創(chuàng)面開放以隨時(shí)觀察創(chuàng)面愈合或感染情況。于室溫 2225C、濕度50%單籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。1.4.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法采用隨機(jī)數(shù)字表法將 450只SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組（90 只）和試驗(yàn)組（ 360 只）。試驗(yàn)組即蘆薈多糖組，隨機(jī)分為 60%、 70%、 80%、 90%蘆薈多糖組，每組 90 只，按外敷、灌 胃（每次10 mL）及混合（外敷及灌胃）3種給藥方式（2次 /d ）,分為三小組，每小組 30只。試驗(yàn)組均按“ ”法配 制10 mg/mL 蘆薈多糖

13、水溶液給藥，對(duì)照組用與試驗(yàn)組等體 積的生理鹽水采取相同給藥方式，如有感染用抗生素外涂。1.4.4 標(biāo)本處理五組大鼠分別于燙傷后 3、7、14 d每小組處死10只。 取創(chuàng)面全層皮膚組織 100 mg ,去除痂皮并吸去血跡， 按1 mL 生理鹽水/100 mg皮膚組織比例碾磨勻漿。 將標(biāo)本于4C以下10 000 r/min （r = 13.5 cm）離心 15 min，取上清液于-20 C 以 下保存。1.5 檢測(cè)指標(biāo)1.5.1 創(chuàng)面愈合率燙傷后3、7、14 d記錄創(chuàng)面愈合程度，將創(chuàng)面描記在半 透明紙上， 以此為模板， 將質(zhì)地均勻的硬紙片剪成同樣大小， 以硬紙片大小間接表示創(chuàng)面面積大小。創(chuàng)面愈合率

14、（%） =（開始燙傷面積-未愈合創(chuàng)面面積）/開始燙傷面積x 100%。1.5.2 FN 含量取燙傷后3、7、14 d燙傷部位皮膚稱重、定容、勻漿， 測(cè)定組織液中FN含量，采用ELISA雙抗夾心法檢測(cè)。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔 10 孔， 1、 2孔分別加 標(biāo)準(zhǔn)品100卩L及稀釋液50卩L,依次混勻、對(duì)倍稀釋至9、 10孔，稀釋后各孔加樣量均為 50卩L,于450 nm波長(zhǎng)處測(cè) 吸光度。取每2孔平均值，以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A（OD 值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 得回歸方程 A = 0.0236C+0.252， R2 = 0.9947。見表 1、圖 1。結(jié)果測(cè)定 設(shè)空白對(duì)照孔（不加樣品及酶標(biāo)試劑

15、） 、待測(cè)樣品孔，按加樣、 溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止步驟操 作。以空白對(duì)照孔調(diào)零，于 450 nm 波長(zhǎng)處依序測(cè)定每孔吸 光度（0D值）,將樣本OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出濃度， 樣品濃度X稀釋倍數(shù)=樣品的實(shí)際濃度。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用 SPSS 19.0軟件分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（x s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ One-way ANO VA）及方差齊性檢驗(yàn)，方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用 Tamhanes T2檢驗(yàn)。以 P 0.05），第 7 天 80%、90%蘆 薈多糖組愈合率明顯高于對(duì)照組（ P 0.05）。見表 2。2.2 各組燙傷創(chuàng)面皮膚組織纖維連接蛋白含量變化比較 燙傷后各組 FN 含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，燙傷 后第 7 天達(dá)高峰， 試驗(yàn)組 FN 含量均高于對(duì)照組， 80%蘆薈多 糖組 FN 含量最高。給藥方式上外敷優(yōu)于灌胃，混合給藥優(yōu)