毛果蕓香堿微乳滴眼劑及滴眼液在兔眼房水中的藥代動力學(xué)研究

1、    毛果蕓香堿微乳滴眼劑及滴眼液在 兔眼房水中的藥代動力學(xué)研究        【摘要】目的對2%毛果蕓香堿微乳滴眼劑與2%毛果蕓香堿滴眼液在兔房水中的藥代動力學(xué)進(jìn)行對比研究。方法健康白兔60只，隨機(jī)分成20組，10個實(shí)驗(yàn)組，10個對照組，每組3只兔（6只眼）。對各實(shí)驗(yàn)組雙眼結(jié)膜囊內(nèi)準(zhǔn)確滴入2%毛果蕓香堿微乳滴眼劑50 l，對各對照組雙眼同法滴入2%毛果蕓香堿滴眼液50 l，分別于給藥后5、10、30、40、60、90、120、180、240及360 min時抽取

2、房水。用二氯甲烷提取房水中的藥物，采用反相高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography, HPLC）法測定房水中的藥物濃度。結(jié)果用反相HPLC法可以將毛果蕓香堿與其它雜質(zhì)分離，最低檢測濃度為0.01 mg/L。2%毛果蕓香堿微乳滴眼劑或滴眼液50 l滴眼后，除5 min時間點(diǎn)外，其余各時間點(diǎn)毛果蕓香堿微乳滴眼劑治療組的房水藥物濃度較毛果蕓香堿滴眼液治療組明顯增高（P=0.000 30.042)。微乳滴眼劑的藥-時曲線下面積是滴眼液的3倍，微乳滴眼劑的生物利用度比滴眼液高2倍。用微乳滴眼劑后6 h，房水中仍可測出毛果蕓香堿的濃度，而用滴眼液后3 h，房水中

3、已測不出毛果蕓香堿的濃度。結(jié)論將毛果蕓香堿滴眼液的劑型改為微乳滴眼劑可明顯提高毛果蕓香堿的生物利用度，增強(qiáng)療效，減少用藥頻率，提高青光眼的治療指數(shù)，具有較好的應(yīng)用前景?！娟P(guān)鍵詞】毛果蕓香堿 藥代動力學(xué) 色譜法，高壓液相 Ocular pharmacokinetics of pilocarpine micron emulsion in rabbitsXU Yan, CHEN Zuji, SONG Jiezhen, et al. Henan Institute of Ophthalmology, Zhengzhou 450003【Abstract】ObjectiveTo compare the p

4、harmacokinetics of pilocarpine micron emulsion with generic pilocarpine solution in the aqueous humor. Methods60 albino rabbits were used and were divided into 20 groups, each consisting of 3 animals. 10 groups received 2% generic pilocarpine 50 l as controls; 10 groups received 50 l of 2% pilocarpi

5、ne micron emulsion in the conjunctival sac. The aqueous humor was withdrawn at 5, 10, 30, 40, 60, 90, 120, 180, 240 and 360 min. after instillation. The drug was extracted from aqueous humor with dichloromethane. The drug was analyzed by reversed phase high pressure liquid chromatography(HPLC). Resu

6、ltsPilocarpine micron emulsion therapy gave higher aqueous humor concentration of the drug than drops at all time periods tested except 5 min. time point (P=0.00030.042). The area under curve of micron emulsion was 3 times as much as that of drops. There was a two-fold increase in ocular bioavailabi

7、lity of pilocarpine due to the therapy with micron emulsion. Measurable amounts of drug following 2% micron emulsion were still observed at 360 min. while drug levels at 180 min. following 2% drop therapy were nil. ConclusionOur study results demonstrated significantly increase in ocular bioavailabi

8、lity of pilocarpine due to the therapy with micron emulsion. Our finding indicates that a novel topical preparation of pilocarpine incorporated in micron emulsion might serve as a long acting antiglaucoma agent, and less frequent applications are necessary with it than with conventional drops.【Key w

9、ords】PilocarpinePharmacokinetics Chromatography, high pressure liquid毛果蕓香堿滴眼液在降低眼壓治療各型青光眼方面療效顯著，是臨床不可缺少的藥物之一。但該劑型有很多缺點(diǎn)，藥物滴眼后立即被結(jié)膜囊中的淚液稀釋，并很快從淚道排出，因此生物利用度低，作用時間短暫，需反復(fù)頻繁滴眼，易發(fā)生局部毒性反應(yīng)及病人依從性差等一系列問題。為了延長毛果蕓香堿滴眼液的藥物作用時間，增強(qiáng)毛果蕓香堿的眼內(nèi)通透性及生物利用度，減少用藥次數(shù)，降低毒性，提高療效，近年來對毛果蕓香堿的長效劑型進(jìn)行了許多研究，目前國外正在研究的劑型有脂質(zhì)體、膠束溶液(micella

10、r solution)、微乳及微粒體等1-4。微乳近年來作為藥物載體受到醫(yī)藥界的重視2，3，5-7。國內(nèi)對這方面的研究剛起步,在眼科制劑方面尚未見有關(guān)報道。我們于1997年起開始研制毛果蕓香堿微乳滴眼劑，并對毛果蕓香堿微乳滴眼劑與毛果蕓香堿滴眼液在兔眼房水中的藥代動力學(xué)進(jìn)行了對比研究。材料與方法一、材料及制劑硝酸毛果蕓香堿為進(jìn)口原料分裝，符合英國藥典；甲醇、磷酸氫二鉀、二氯甲烷為國產(chǎn)分析純。將硝酸毛果蕓香堿制備成2%的毛果蕓香堿微乳滴眼劑，另制備2%毛果蕓香堿滴眼液作對照。 二、方法1.實(shí)驗(yàn)動物：健康白兔60只，雌雄兼用，體重23 kg，隨機(jī)分成20組，10個實(shí)驗(yàn)組，10個對照組，每組3只兔（

11、6只眼）。2.滴眼及房水標(biāo)本采集：用微量取樣器分別對各實(shí)驗(yàn)組家兔雙眼結(jié)膜囊內(nèi)滴2%毛果蕓香堿微乳滴眼劑50 l，對各對照組家兔雙眼結(jié)膜囊內(nèi)滴2%毛果蕓香堿滴眼液50 l。房水標(biāo)本采集時間為給藥后5、10、30、40、60、90、120、180、240及360 min。所有樣品均儲存于-20下，以備測定。3.樣品提取方法：取房水200 l，加二氯甲烷4ml，振蕩2 min。以3 000 r/min離心10 min。取有機(jī)層，50氮?dú)饬飨麓蹈桑尤肓鲃酉?00 l振蕩4 min溶解，取50 l注入液相色譜儀中，將峰面積代入回歸曲線，求得所測試樣品濃度。4.反相HPLC法測定：采用的高壓液相色譜儀為

12、日本島津LC-10A型。色譜條件：色譜柱為Spherisorb C18， 200.0 mm×4.6 mm,粒度5 m；流動相為0.073 mol/L磷酸氫二鉀-甲醇（80：20）；流速1.5 ml/min，檢測波長為215 nm，柱溫為55，進(jìn)樣量為50 l。峰面積與濃度做線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度系列為0.2、0.5、1.0、2.0 、4.0和8.0 mg/L,最低檢測限為0.01 mg/L,以外標(biāo)法進(jìn)行定量。用 0.5、1.0和2.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行方法精密度和重現(xiàn)性考察；用0.5、1.0和2.0 mg/L 3種濃度進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用t檢驗(yàn)，以P<

13、0.05作為差異有顯著性標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果一、一般情況2%毛果蕓香堿微乳滴眼劑及2%毛果蕓香堿滴眼液滴眼后，各時間點(diǎn)均未出現(xiàn)眼瞼痙攣、結(jié)膜充血、結(jié)膜水腫及流淚等刺激癥狀。二、毛果蕓香堿的色譜特征毛果蕓香堿的保留時間為5.6 min，空白不干擾測定。以峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸，房水中毛果蕓香堿的濃度在0.28.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 9。三、HPLC測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度和重現(xiàn)性（表1）表1HPLC測定標(biāo)準(zhǔn)溶液5次的日內(nèi)精密度和日間重現(xiàn)性濃度(mg/L)日內(nèi)（n=5）日間（n=5）峰面積RSD*（%）峰面積RSD*（%）0.516 659±329.92.016 179&#

14、177;6255.33.91.037 723±1924.75.137 012±1996.55.42.082 037±629.60.880 930±1594.21.9*相對標(biāo)準(zhǔn)差 四、房水中毛果蕓香堿的回收率由表2可見兔眼房水中不同濃度毛果蕓香堿的回收量及回收率，平均回收率為89.3%。表2兔眼房水中不同濃度毛果蕓香堿的回收率毛果蕓香堿加入量(mg/L)回收量（±s,mg/L）回收率（%）0.50.42±0.0183.61.00.89±0.0489.32.01.90±0.0895.1 五、毛果蕓香堿在房水中的濃度變化

15、1.2%毛果蕓香堿滴眼液組：用2%毛果蕓香堿滴眼液50 l滴眼1次后，30 min時房水中的藥物濃度達(dá)到最高值（2.25 mg/L），60min時房水中的濃度僅為30 min時的7%，120 min時房水中的濃度是30 min時的4%，180 min時房水中已檢測不出藥物（表3）。 表3毛果蕓香堿兩種劑型滴眼劑滴眼后房水中藥物濃度(mg/L)時間(min)微乳滴眼劑滴眼液P值51.90±0.401.59±0.850.4762104.57±1.821.89±1.370.0164305.37±2.832.25±1.050.0299401.

16、39±1.100.34±0.160.0419601.10±0.680.16±0.050.0076900.52±0.170.14±0.020.00031200.34±0.110.10±0.030.00041800.27±0.1000.0000072400.11±0.0800.00743600.06±0.0300.0031 2. 2%毛果蕓香堿微乳滴眼劑組：用2%毛果蕓香堿微乳滴眼劑50 l滴眼1次后，30 min時房水中藥物濃度達(dá)最高值（5.37 mg/L）。60 min時房水中的濃度是

17、30 min時的20%，120 min時房水中的濃度是30 min時的6%，360 min時房水中的濃度是30 min時的1%（表3）。3. 2%毛果蕓香堿微乳滴眼劑與2%毛果蕓香堿滴眼液的比較：2%毛果蕓香堿微乳滴眼劑或滴眼液50 l滴眼后，除5min時間點(diǎn)外，其余各時間點(diǎn)毛果蕓香堿微乳滴眼劑治療組的房水藥物濃度較毛果蕓香堿滴眼液組明顯增高（P=0.000 30.042)。微乳滴眼劑的藥-時曲線下面積是滴眼液的3倍，微乳滴眼劑的生物利用度比滴眼液高2倍。用微乳后6 h,房水中仍可以測出毛果蕓香堿的濃度，而用滴眼液后3 h，房水中已測不出毛果蕓香堿。 討論一、微乳制劑的藥用特點(diǎn)微乳是一種特殊的

18、液-液分散體系，微乳除具有乳劑的一般特性外，還具有粒徑小、透明、穩(wěn)定、吸收迅速完全及易于過濾等特殊優(yōu)點(diǎn)，實(shí)用價值較大，在藥物制劑方面應(yīng)用廣泛5-7。我們將毛果蕓香堿制備成微乳滴眼劑，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)證明該劑型可明顯增加毛果蕓香堿的角膜滲透性，提高毛果蕓香堿的生物利用度。二、微乳制劑提高毛果蕓香堿生物利用度的可能機(jī)制微乳劑型增加毛果蕓香堿角膜滲透性的機(jī)制主要與微乳的結(jié)構(gòu)有關(guān)。在微乳制劑中，毛果蕓香堿不僅可分布在水相，還可分布在極小的油滴內(nèi)及油水交界處，這樣將使毛果蕓香堿穿透角膜的能力大大增加。微乳還具有一定的緩釋作用。Naveh等2推測毛果蕓香堿微乳可能是通過角膜上皮粘蛋白層的吸收，與角膜形成較強(qiáng)的親和

19、力，從而明顯增加角膜內(nèi)的毛果蕓香堿濃度。而角膜上皮層中毛果蕓香堿的含量占角膜內(nèi)總含量的80%，其可作為一個儲庫持續(xù)向房水內(nèi)釋放毛果蕓香堿。此外，微乳進(jìn)入角膜上皮后，經(jīng)過藥物從微乳內(nèi)部向介質(zhì)中重新分配的過程，使藥物的釋放延長，提高了藥物的生物利用度。本實(shí)驗(yàn)中毛果蕓香堿微乳滴眼劑的藥物峰值濃度較滴眼液明顯增高，微乳滴眼劑的藥物消除時間較滴眼液明顯延長，微乳滴眼劑的藥-時曲線下面積是滴眼液的3倍，微乳滴眼劑的生物利用度比滴眼液高2倍。這些均提示微乳有增加毛果蕓香堿的角膜滲透性和角膜內(nèi)儲存及一定的緩釋作用。三、毛果蕓香堿微乳滴眼劑與滴眼液降眼壓作用及縮瞳作用的比較Naveh等2的兔眼實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用毛果

20、蕓香堿微乳滴眼劑50 l滴眼1次，降眼壓作用可持續(xù)29 h,而滴眼液的作用僅持續(xù)5h。Beilin等3制備了毛果蕓香堿亞微乳制劑，實(shí)驗(yàn)表明與毛果蕓香堿水溶液組相比，亞微乳制劑組的縮瞳時間持久。Mahato等4的一項(xiàng)關(guān)于毛果蕓香堿微乳滴眼劑期臨床實(shí)驗(yàn)表明：2%毛果蕓香堿亞微乳制劑，每天給藥2次與2%的水溶液每天給藥4次相比，降眼壓作用差異無顯著性，且未見與藥物相關(guān)的眼及全身毒副作用。該項(xiàng)研究認(rèn)為毛果蕓香堿亞微乳制劑每天給藥2次，可以用于青光眼的治療。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中房水藥物濃度的改變支持上述作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。四、結(jié)論我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，滴用毛果蕓香堿微乳滴眼劑組房水中藥物的濃度比滴眼液組顯著增高，

21、藥物在房水中的存留時間較滴眼液組顯著延長，說明將毛果蕓香堿滴眼液的劑型改為微乳滴眼劑可明顯提高毛果蕓香堿的生物利用度，增強(qiáng)療效，減少用藥頻率，提高青光眼的治療指數(shù)，具有較好的應(yīng)用前景。作者單位：450003 鄭州，河南省眼科研究所參考文獻(xiàn)1Fitzgerald P, Hadgraft J, Wilson CG. A gamma scintigraphic evaluation of the precorneal residence of liposomal formulations in the rabbit. J Pharm Pharmacol, 1987,39:487-490.2Naveh N, Muchtar S, Benita S. Pilocarpine incorporated into a submicron emulsion vehicle cause an unexpectedly prolonged ocular hypotensi