辣椒堿類化合物及辣椒堿單體的提取與純化-

1、 碩士學(xué)位論文 論文題目辣椒堿類化合物及辣椒堿單體的提取與純化作者姓名 艾 秀 珍指導(dǎo)教師 任 其 龍 教 授沈 波 副 教 授 學(xué)科(專業(yè) 生 物 化 工所在學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院提交日期 2007年05月 Extraction and Purification of Capsaicinoidsand CapsaicinA DissertationSubmitted toZhejiang University for Master Degree of EngineeringWritten byAi XiuzhenMajoring inBiochemical EngineeringSuper

2、vised byProf. Ren QilongAnd Associate Prof. Shen BoCollege of Material Science and Chemical EngineeringZhejiang UniversityMay,2007摘 要本文研究了從辣椒精(辣椒堿類化合物含量為34.89%中提取與純化辣椒堿類化合物及辣椒堿單體的方法與工藝,包括溶劑法粗提辣椒堿類化合物、大孔吸附樹脂法與結(jié)晶法精制辣椒堿類化合物、反相型高效液相制備色譜法從辣椒堿類化合物精品中制備辣椒堿單體。在溶劑提取法粗提辣椒堿類化合物的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中,考察了皂化、有機(jī)溶劑萃取、碳酸鈉溶液反萃雜質(zhì)、氫氧化

3、鈉溶液反萃辣椒堿類化合物的條件對辣椒堿類化合回收率與純度的影響,得到提取辣椒堿類化合物粗品的最佳工藝條件:5%的氫氧化鈉水溶液皂化辣椒精,皂化回收率為98.74%,辣椒堿類化合物純度從34.89%提高到65.20%;皂化液調(diào)pH值至9.57,用乙醚萃取2次,乙醚相中辣椒堿類化合物回收率為98.75%,純度為90.49%;乙醚相再用2%的氫氧化鈉水溶液萃取3次,堿液中辣椒堿類化合物回收率為91.14%,純度為94.52%;三步總回收率為88.87%。在辣椒堿類化合物粗品的純化實(shí)驗(yàn)中,采用大孔吸附樹脂法與結(jié)晶法兩種方法精制辣椒堿類化合物。在大孔吸附樹脂法實(shí)驗(yàn)中,選用ADS-8聚苯乙烯型非極性樹脂作

4、為吸附材料,以單因素實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化了五個(gè)影響因素:上樣液濃度、吸附流速、上樣液pH值、洗脫劑種類、洗脫流速。以上樣量為指標(biāo),確定了最佳的吸附條件:吸附流速為1.91 BV/h,上樣液pH值為12.30;以辣椒堿類化合物的回收率與純度為指標(biāo),確定了最佳的洗脫條件:20%酸性乙醇溶液洗脫殘留辣椒堿類化合物和雜質(zhì),70%的乙醇洗脫劑洗脫被吸附的辣椒堿類化合物,洗脫流速為1.35BV/h,產(chǎn)品的回收率為69.41%,純度為99.91%。在辣椒堿類化合物結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中,考察了堿液pH值、結(jié)晶溫度對辣椒堿類化合物純度與回收率的影響,結(jié)果適宜的pH值為12.0212.21之間,結(jié)晶溫度為10,辣椒堿類化合物的純度

5、為98.73%,回收率為88.77%。兩種方法都得到了較高純度的辣椒堿類化合物精品,大孔吸附樹脂法得到的產(chǎn)品的純度稍優(yōu)于結(jié)晶法,但回收率低于結(jié)晶法,且結(jié)晶法操作更簡便。在反相型高效液相制備色譜制備辣椒堿單體的實(shí)驗(yàn)中,以2根ODS柱(100mm×20mm id為制備色譜柱,考察了流動相組成、進(jìn)樣濃度、進(jìn)樣體積和流動相流速等對分離的影響,確定了適宜的工藝操作條件:流動相為甲醇/水(75/25,v/v,進(jìn)樣濃度為180mg/ml,進(jìn)樣體積為2.08ml,流速為4.0ml/min。在該工藝條件下,得到的辣椒堿單體純度為95.23%,回收率為93.27%,產(chǎn)率為4.38g/(L.h,流動相消耗

6、為0.087L/g。本方法操作簡便,分離效率高,產(chǎn)品質(zhì)量好,為辣椒堿單體的制備研究提供了一種較好的方法。全文建立了辣椒堿類化合物及辣椒堿單體的HPLC分析方法。關(guān)鍵詞:辣椒堿類化合物 辣椒堿單體 提取 大孔吸附樹脂 結(jié)晶 反相型高效液相制備色譜ABSTRACTA process for extracting and purifying capsaicinoids and capsaicin from capsicum oleoresin was studied in this paper.The process includes extracting coarse capsaicinoids

7、by solvent, purifying capsaicinoids by macroporous resin and crystalliz- ation,and preparating capsaicin by reversed-phase preparative liquid chromatog- raphy.In the experiments of extraction of coarse capsaicinoids by solvent, the optimal operation conditions were obtained by studying the effects o

8、f saponification and extraction on the purity and recovery. Firstly, capsicum oleoresin was saponified by a sodium hydroxide solution of 5% content, and the recovery was 98.74% while purity of capsaicinoids was improved from 34.89% to 65.20%. Secondly, the pH of saponified solution was conditioned t

9、o 9.57 and extracted with ether two times to increase the purity to 90.49% with a recovery of 98.75%. Thirdly, a 2% sodium hydroxide solution extracted the above ether raffinate three times and the purity was improved to 94.52 % with a recovery of 91.14%. Through the three processes, the capsaicinoi

10、ds of 94.52% could prepared from capsicum oleoresin with the total recovery of 88.87 %.In the experiments of purifying capsaicinoids,the methods of macroporous resin and crystallization were studied.In the method of macroporous resin,the effects of the concention,flow rate,pH value of capsaicinoids

11、on the adsorption and the concention,flow rate on the desorption were studied.The optimal operations conditions were obtained:loading flow rate:1.91BV/h;loading sample pH:12.3 0; eluant:firstly 20% acidic ethanol solution,then 70% ethanol solution;eluating flow rate: 1.35BV/h .The purity and the rec

12、overy of product were 99.91% and 69.41% respectively. In the method of crystallization, pH 12.0212.21and 10 were the optimal conditions.The purity of the product was 98.73% with the recovery 88.77 %.Through these experiments,high purity product can be obtained by the two methods. The purity of the p

13、roduct prepareded by the mothod of macroporous resin islitterly higher than the product by crystallization,but the recovery is lower.The method of crystallization can be operated more simply .In the experiments of capsaicin by reversed-phase preparative liquid chromatog- raphy, the effects of mobile

14、 phase composition and flow rate, feed concentration and volume on the purity, productivity, recovery and mobile phase consumption were studied. With two ODS column(100mm×20mm id,the optimal operation conditions are mobile phase with methanol/water(75/25,V/V, sample concentration with 180mg/ml,

15、 sample volume with 2.08ml and flow rate with 4ml/min.Under such conditions, capsaicin with purity of 95.23% could be obtained, and the productivity, recovery and mobile phase consumption were 4.38g/L, 93.27% and 0.087L/g, respectively. The result shows that the method proposed is simple and high ef

16、ficient. It was provided a new method for the preparative of capsaicin.In this paper,the analytical method for capsaicinoids and capsaicin was HPLC.Keywords: capsaicinoids; capsaicin; extraction; macroporous resin; crystallization; reversed-phase preparative liquid chromatography目 錄摘 要.I ABSTRACT.II

17、I 前 言. (1第一章 文獻(xiàn)綜述 (31.1辣椒簡介 (31.2辣椒的化學(xué)成分及理化性質(zhì) (31.3辣椒堿類化合物的應(yīng)用 (51.4辣椒堿類化合物的提取方法 (81.5辣椒堿類化合物的純化方法 (101.6辣椒堿單體的制備方法 (121.7辣椒堿類化合物的分析方法 (181.8本文研究內(nèi)容 (19第二章 辣椒堿類化合物粗品的提取 (212.1辣椒堿類化合物分析方法的建立 (212.2萃取法提取辣椒堿類化合物 (232.3 小結(jié) (30第三章 辣椒堿類化合物粗品的純化 (313.1大孔吸附樹脂法純化辣椒堿類化合物粗品 (313.2結(jié)晶法純化辣椒堿類化合物粗品 (413.3小結(jié) (43第四章 反

18、相型高效液相制備色譜法制備辣椒堿單體 (454.1制備色譜柱的裝填 (454.2反相型高效液相制備色譜法制備辣椒堿單體 (494.3小結(jié) (56第五章 總結(jié)與展望 (58參考文獻(xiàn) (60致 謝 (66發(fā)表論文情況 (67前 言辣椒(Capsicum又名大椒,辣子,番椒等,屬于一年生草本茄科植物,是人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｓ玫男料懔?。它含有大量生理活性物質(zhì),包括生物堿,色素,有機(jī)酸,維生素,礦物質(zhì)等。目前,國內(nèi)外對辣椒堿色素和辣椒堿類化合物研究最多。辣椒色素是一類橙紅色色素,主要包括辣椒紅素(Capsanthin、辣椒玉紅素(Capsorubin和極性較小的胡羅卜素(carotenone和玉米黃質(zhì)(Ze

19、axanthin等,可從成熟的紅辣尖椒中提取。由于辣椒色素具有色價(jià)高、安全無毒、抗癌美容的特點(diǎn),被廣泛的應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化妝品等行業(yè)。辣椒堿類化合物(Capsaicinoids是辣椒果實(shí)中結(jié)構(gòu)為N香草基酰胺類生物堿,是辣椒中引起辛辣味的主要物質(zhì),主要包括辣椒堿(Capsaicin,降二氫辣椒堿(Nordihydrocapsaicin,二氫辣椒堿(Dihydrocapsaicin等。研究表明,它具有長效鎮(zhèn)痛,抗菌消炎,促進(jìn)食欲,改善消化等藥理作用,對帶狀皰疹后神經(jīng)痛,牛皮癬,皮膚搔癢癥,糖尿病性神經(jīng)痛等癥狀均具有明顯的治療效果。它還可廣泛的用于食品工業(yè)、軍事彈藥、有害生物防治等方面。由于辣椒堿

20、類化合物中的幾種生物堿結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)都較為接近,因而對辣椒堿的功能研究都是以辣椒堿類化合物為研究對象。但目前有資料表明,辣椒堿類化合物中有些成分有拮抗辣椒堿對神經(jīng)肽的的藥用作用,它們能增加C型感覺神經(jīng)元的P物質(zhì)的合成,加劇疼痛和炎癥,因而有必要將辣椒堿單體從辣椒堿類化合物中分離出來,便于研究辣椒堿與其它物質(zhì)的作用關(guān)系,以期發(fā)揮更好的藥理作用。近十幾年來,制取辣椒堿類化合物的專利技術(shù)不斷問世。我國最早的關(guān)于辣椒堿類化合物的研究見于1994年天津輕工業(yè)學(xué)院姚寶書的專利報(bào)道1,報(bào)道中以辣椒皮粉為原料,用乙醇、乙醚、石油醚等為萃取劑,通過分相萃取提取分離辣椒堿類化合物。隨后亦有廈門大學(xué)的吳明光2用柱層

21、析與萃取法相結(jié)合的方法得到辣椒堿類化合物。黃啟強(qiáng)3申請過超臨界二氧化碳萃取技術(shù)分離純化辣椒堿類化合物的專利。張世文4等用萃取-結(jié)晶的方法對辣椒堿類化合物的提取進(jìn)行研究。隨著對辣椒堿類化合物的藥理研究的不斷加深,關(guān)于高純辣椒堿類化合物的提取研究也明顯增多。例如:郭進(jìn)寶5離子交換樹脂制備高純辣椒堿類化合物,李美粉6用超聲法從辣椒中提取辣椒堿類化合物等。由于辣椒堿類化合物中的幾種生物堿結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)都較為接近,很難用常規(guī)的分離方法將辣椒堿單體從辣椒堿類化合物中分離出來,因而關(guān)于辣椒堿單體的制備研究的方法報(bào)道很少見,國內(nèi)主要見吳波7等人報(bào)道用反相高效液相制備色譜法能夠分離制得辣椒堿單體,但是文章中沒有

22、更進(jìn)一步研究辣椒堿單體的制備工藝條件。本文的研究工作主要側(cè)重于高純辣椒堿類化合物(純度大于98%的提取純化及辣椒堿單體的制備。系統(tǒng)研究了有機(jī)溶劑粗提辣椒堿類化合物,大孔吸附樹脂法和結(jié)晶法精制辣椒堿類化合物的提取純化工藝,并對其參數(shù)進(jìn)行了選擇和優(yōu)化。同時(shí)研究了反相制備型高效液相色譜法分離制備辣椒堿單體的工藝,確定了適宜的工藝參數(shù)。整篇論文運(yùn)用分析型高效液相色譜分析各個(gè)步驟中辣椒堿類化合物及辣椒堿單體的含量。第一章 文獻(xiàn)綜述1.1 辣椒簡介辣椒(Capsicum又名大椒,辣子,番椒等,屬于一年生草本茄科植物。果實(shí)通常成圓錐形或長圓形,未成熟時(shí)呈綠色,成熟后變成鮮紅色、黃色或紫色,以紅色最為常見。辣

23、椒的果實(shí)因果皮含有辣椒堿而有辣味,能增進(jìn)食欲。辣椒中維生素C的含量在蔬菜中居第一位。辣椒原產(chǎn)于中南美洲熱帶地區(qū),15世紀(jì)末,哥倫布發(fā)現(xiàn)美洲之后把辣椒帶回歐洲,并由此傳播到世界其它地方。于明代傳入中國。清陳淏子之花鏡有番椒的記載。今中國各地普遍栽培,成為一種大眾化蔬菜。辣椒變種很多,指天椒、簇生椒、小指椒、長辣椒等果實(shí)尖長而辣者可以入藥,而形圓且不辣者如燈籠椒及青辣椒不作為藥用。1.2 辣椒的化學(xué)成分及理化性質(zhì)辣椒中引起辛辣味的物質(zhì)主要是辣椒堿類化合物,最早由Thres(1876從辣椒果實(shí)中分離出來,并命名為辣椒堿(Capsaicin,Capsaicinoids,又稱辣椒素;到1919年,Nel

24、son報(bào)道了辣椒堿類化合物的結(jié)構(gòu),表明它們是一種酰基化的香草酸同源同系物高香草酸(Nomovanillic。此后又有一些辣椒堿的同系物從辣椒果實(shí)中被發(fā)現(xiàn),它們統(tǒng)稱為辣椒堿類化合物 8。至今已發(fā)現(xiàn)14種以上的辣椒堿同系物,它們的具體種類及含量與辣椒的品種和成熟度有關(guān),主要有辣椒堿(Capsaicin,降二氫辣椒堿(Nordihydrocapsaicin,二氫辣椒堿(Dihydrocapsaicin,高二氫辣椒堿(Homodihydrocapsaicin等,它們的分子結(jié)構(gòu)式如圖1.1:辣椒堿(Capsaicin 是辣椒辛辣味和具有藥物功能的主要來源,其化學(xué)結(jié)構(gòu)名稱為:N-(4-hydroxy-3-

25、methoxyphoxyl-methyl-8-methyl-(E-6-none namide ;即(4-羥基-3-甲氧基苯基-甲基8-甲基-(反-6-壬烯酞胺,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1.1。分子式為C 18H 27NO 3,分子量305.41,其純品呈單斜長方形片狀無色晶體,熔點(diǎn)為64.5,沸點(diǎn)210220。易溶于甲醇,乙醇,丙酮,氯仿及乙醚中,因其具有酚羥基而呈弱酸性,則可溶于堿性水溶液中。辣椒堿可被水解為香草基胺和癸烯酸,且可與斐林試劑發(fā)生呈色反應(yīng)910。辣椒色素是存在于成熟辣椒中的一類橙紅色色素,主要包括極性較強(qiáng)的辣椒紅素、辣椒玉紅素和極性較小的胡羅卜素和玉米黃質(zhì)。辣椒紅色素不溶于水,易溶于乙醇

26、、己烷、油脂等。具有色澤鮮艷、著色力強(qiáng),保色效果好的特點(diǎn),而且耐熱,耐鹽,耐酸,耐金屬,耐微生物。由于辣椒紅色素?zé)o毒副作用,安全性高,并具有較高的營養(yǎng)保健作用,越來越受消費(fèi)者的喜愛。辣椒紅素及辣椒玉紅素的結(jié)構(gòu)式見圖1.211:圖1.1 辣椒堿類化合物結(jié)構(gòu)式Fig 1.1 The chemical structure of CapsaicinoidsA. NordihydrocapsaicinB.CapsaicinC.DihydrocapsaicinD. HomodihydrocapsaicinCH 3NH CO (CH 26CHCH 3CH 3CH 3OHOCH 2NHCO(CH 27CHCH

27、 3CH 3C DBCH 3OHOCH 2NH CO (CH 25CHCH 3CH 3CH 3OH OC H 2N H C O (C H 24C H H C H CCH 33B辣椒中除含有辣椒堿類化合物和辣椒色素外,還含有多種維生素(維生素A 、維生素D 、維生素P 、維生素E 、維生素K ,20多種礦物質(zhì),不飽和脂肪酸(主要為油酸和亞油酸,蛋白質(zhì),糖體等12。它們對人體均具有一定的營養(yǎng)保健作用。1.3 辣椒堿類化合物的應(yīng)用人和動物內(nèi)服或者局部使用辣椒堿類化合物都顯示對傷害性熱和化學(xué)品刺激所引起的疼痛有明顯的失敏作用13。例如,辣椒素對扭體試驗(yàn)的半數(shù)有效鎮(zhèn)痛劑量為1.4mg/kg 14。如果皮

28、下注射10mg/(kg.d連續(xù)3天或1次注射50mg/kg ,大鼠對熱板刺激的鎮(zhèn)痛作用持續(xù)8周15。美國科學(xué)家Geoffrey AC 16也在研究中表明,辣椒堿類化合物的鎮(zhèn)痛作用與嗎啡等同,但比嗎啡更持久,嗎啡的鎮(zhèn)痛作用為6h ,而辣椒堿類化合物的鎮(zhèn)痛效果可達(dá)710天。國內(nèi)的劉鄉(xiāng)17早在1997年也在研究中提到辣椒堿類化合物是C 與A 類纖維特異性阻斷劑,可以減弱傷害性刺圖1.2 辣椒紅素及辣椒玉紅素結(jié)構(gòu)式Fig 1.2 The chemical structure of capsanthin and capsorubinA capsanthinB capsorubinCH 3CH 3CH 3

29、CH 3CH 3CH 3CH 3CH 3CH 3OH CH 3OH OHOH 3C H3C H3COC H3激信息的傳入沖動,從而體現(xiàn)出鎮(zhèn)痛作用。他將1%5%辣椒堿類化合物作用于腓總神經(jīng)干,以阻斷來自足三里C纖維的傳入沖動,在45分鐘內(nèi)觀察到C波明顯減少。還有在膀胱內(nèi)灌注辣椒堿類化合物溶液治療神經(jīng)源性的膀胱過激和痛覺過敏的療效在200例患者的臨床試驗(yàn)中得到清楚地證明18。辣椒堿類化合物使患者膀胱內(nèi)神經(jīng)纖維密度減少,從而得到了較長時(shí)間的癥狀緩解19。華景清20也在文中提到墨西哥國立自治大學(xué)的加西亞教授從辣椒籽和辣椒果實(shí)薄膜中提取的辣椒堿類化合物涂在皮膚上可起止痛作用,對抑制關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病和糖尿病

30、引起的疼痛也具有良好療效。另外,辣椒膏對帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛、糖尿病性神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛等都有很好的療效21-24。辣椒堿類化合物對用丁酸菌、p物質(zhì)和鹿角菜膠引起的動物關(guān)節(jié)炎有顯著的抗炎作用。向大鼠膝關(guān)節(jié)滑液腔注射辣椒堿類化合物20mg,15周后注射神經(jīng)源致炎化合物P物質(zhì)20g,沒有引起炎癥反應(yīng),而對照組產(chǎn)生顯著的炎癥癥狀。辣椒堿類化合物對用2%鹿角菜膠注射關(guān)節(jié)內(nèi)引起的炎癥亦有顯著抗炎作用。在炎癥發(fā)生之前或炎癥發(fā)展至高峰,服用辣椒堿類化合物均有顯效25。辣椒堿類化合物對用組織胺或P物質(zhì)引發(fā)的人體皮膚炎癥也有顯著的抗炎作用,如 Wallengen Joanna26等人在8名自愿者左上臂涂抹0.1%

31、的辣椒堿類化合物乙醇溶液,連續(xù)3天,然后注射10-7克分子P物質(zhì)生理鹽水溶液0.05ml,對照組在3min 后出現(xiàn)紅腫的炎癥反應(yīng),15min炎癥達(dá)到高峰,而用辣椒堿類化合物預(yù)先處理的受試者只有輕微的紅腫反應(yīng)。皮下注射10-5M組織胺生理鹽水溶液0.05ml,對照組同樣出現(xiàn)炎癥反應(yīng),而用預(yù)先辣椒堿類化合物處理過的受試者有75%沒有紅腫反應(yīng),25%的只有輕微的紅腫,表明辣椒堿類化合物對人體皮膚炎癥有抗炎作用。另外,肖安菊27等人用辣椒堿類化合物霜給因二甲苯、巴豆油引起的耳廓腫脹的小白鼠涂抹,結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用辣椒堿類化合物后,小白鼠的腫脹耳廓重量明顯減輕,說明辣椒堿類化合物有抗炎作用。金涌28也研究表

32、明,辣椒堿類化合物能明顯抑制角叉采膠誘導(dǎo)的大鼠足腫脹,提示辣椒堿類化合物有明顯的抗炎作用。辣椒堿類化合物還有抗癌作用,對脂質(zhì)過氧化具有調(diào)節(jié)作用,能保護(hù)心肌,對人體消化性潰瘍具有防治作用,對血壓和體溫均有影響,還能治療帶狀皰診,皮膚搔癢癥,糖尿病性神經(jīng)痛,嚴(yán)重牛皮癬,禿發(fā)等癥狀29。辣椒堿類化合物在生物農(nóng)藥中的新用途不斷得到開發(fā),其市場發(fā)展前景相當(dāng)廣闊。在生物農(nóng)藥領(lǐng)域中,該產(chǎn)品作為新型綠色農(nóng)藥具有良好的觸殺、驅(qū)避作用,對農(nóng)作物蟲害防治達(dá)到藥效高、持效長和可降解的特點(diǎn),是21世紀(jì)中的新型環(huán)保型生物。早在1991年美國環(huán)保局(EPA就已經(jīng)確認(rèn)辣椒堿類化合物及其制品為生化農(nóng)藥,并免除了施用于水果、蔬菜

33、及谷物上殘留量的限制,從而使其在農(nóng)藥中的市場用量劇增。我國的廈門南草坪生物工程有限公司通過長期的試驗(yàn)研究,通過對該產(chǎn)品進(jìn)行優(yōu)化篩選混配,已開發(fā)出乳劑型產(chǎn)品,并通過了農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所定點(diǎn)田間藥效驗(yàn)證,得到了推廣應(yīng)用。目前,該公司已取得了國家的發(fā)明專利,并已建成了規(guī)模型的生產(chǎn)裝置。在軍事領(lǐng)域該產(chǎn)品具有良好的催淚作用,且無毒副作用,因此在軍事上是制造催淚彈、催淚槍和防衛(wèi)武器的主要原料,在美國、日本、德國以及東南亞等國家都已廣泛應(yīng)用。該產(chǎn)品在涂料領(lǐng)域主要作為高檔特種防腐涂料,用于輪船外殼,可以有效防止海藻與海洋生物附著,同時(shí)無污染性;用于地下電纜,可以防止白蟻等昆蟲的侵蝕,且作用持久。低濃度的辣椒堿類

34、化合物是優(yōu)良的食品添加劑,與辣椒紅色素混合后,用做火鍋底料、涼菜、休閑食品、方便食品、快餐、微波爐食品等調(diào)味用,起到色、香、味具佳的效果,應(yīng)用相當(dāng)普遍。日本醫(yī)學(xué)專家認(rèn)為辣椒減肥的奧妙在于其含有大量的辣椒堿類化合物。辣椒堿類化合物能加速脂肪組織的代謝與分解,促進(jìn)能量消耗,從而防止體內(nèi)脂肪過多積聚。達(dá)到控制體重,減肥健美的目的,目前辣椒堿類化合物減肥產(chǎn)品已成為愛美減肥一族的熱門產(chǎn)品。1.4 辣椒堿類化合物的提取方法一直以來,辣椒堿類化合物不能人工合成得到,只能從辣椒中提取分離出來。最傳統(tǒng)的分離方法就是用有機(jī)溶劑從辣椒中將辣椒堿類化合物提取出來。一般將干辣椒粉碎,再用一種有機(jī)溶劑抽提,得到一種暗紅色

35、或者是橙色的油狀液體30。這種油狀液體就是國際上所說的辣椒油樹脂31,其中含有辣椒堿、二氫辣椒堿,降二氫辣椒堿,高二氫辣椒堿和辣椒紅色素等,它們的收率(以干辣椒為基準(zhǔn)一般可以達(dá)到15%以上。得到的辣椒油樹脂再經(jīng)過乙醇或者乙醚,堿溶液進(jìn)一步提取,可得到辣椒堿和二氫辣椒堿的含量達(dá)到75%95%。例如,張世文4等人以辣素(辣椒堿類化合物含量6.83%為原料,將其溶入2%的氫氧化鈉的溶液中,再以5%的硫酸酸化,后用正己烷萃取并濃縮,可以得到純度達(dá)85%以上的辣椒堿類化合物粗品,再加以結(jié)晶,純度則可達(dá)92.5%,回收率(以辣素為基準(zhǔn)為2.24%。孫永華32等人在文獻(xiàn)中也報(bào)道過溶劑萃取法的方法:先將原料粉

36、碎,然后進(jìn)行浸提(78倍的90%95%乙醇,4050,浸提35h,熱過濾,再減壓蒸餾,最后進(jìn)行萃取(56倍的70%80%的乙醇,6070萃取,攪拌后冷卻分層,辣椒堿類化合物層重復(fù)上述過程。施飛群 33-34 采用高濃度乙醇提取辣椒紅色素,低濃度乙醇提取辣椒堿類化合物的方法,從干辣椒中分別提取出回收率為6%8%的辣椒堿類化合物和回收率為3%4%的辣椒紅色素。王中秋35用丙酮從干辣椒中提取辣椒堿類化合物也取得了較好的效果。此種方法操作簡便,但是文獻(xiàn)報(bào)道的方法均存在收率較低,產(chǎn)品純度不高等特點(diǎn)。本文將研究一條更經(jīng)濟(jì)的溶劑提取法。隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,超臨界二氧化碳逐步用于辣椒堿類化合物的提取分離。超

37、臨界流體是指處于超過物質(zhì)本身的臨界壓力與溫度狀態(tài)時(shí)的流體。超臨界萃取是以超臨界流體為萃取劑、在臨界溫度和壓力附近的條件下,從溶劑或固體物料中萃取出待分離組分的一種分離純化方法。趙亞平36首次利用超臨界從辣椒中分離提取出辣椒堿類化合物,并且通過對溫度、壓力、原料粒度等因素的考察,摸索出了一條較好的工藝路線。張彥雄37在超臨界萃取釜中加入辣椒粉,在2030Mp,3540條件下,加入10%15%的酒精作為夾帶劑,進(jìn)行超臨界CO2萃取。一般萃取23h,萃取液再經(jīng)濃縮、結(jié)晶等處理,可得到純度90 %的辣椒堿類化合物。國外,Nair38等人早在1994年就研究了用超臨界二氧化碳從辣椒中提取辣椒堿及二氫辣椒

38、堿,結(jié)果辣椒堿及二氫辣椒堿的收率分別是3.2%和0.58%。Gnayfeed 39 等人也用超臨界二氧化碳從辣椒中提取出辣椒堿類化合物,研究表明,在400bar,55的條件下,辣椒堿類化合物的萃取效果最好。辣椒堿類化合物分子中有酚羥基,呈弱酸性,可以與強(qiáng)堿發(fā)生反應(yīng)。趙愛云40以辣椒精為原料,以氫氧化鈉堿溶液為溶劑,利用紫外光譜法,對溶劑濃度、溶劑用量、浸提時(shí)間、浸提溫度等因素進(jìn)行了研究,獲得了較理想的提取條件,其中堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%,浸提時(shí)間2h,浸提溫度80,液固比為9ml/g,結(jié)果從10g的辣椒精中分離得到0.084g的辣椒堿類化合物。王劍平10在文章中提到,將辣椒粉倒入浸提灌中,加入4

39、倍體積的醋酸乙酯(77,酸堿處理,將油狀物倒入反應(yīng)鍋,加入等量的30%氫氧化鈉溶液,加熱到80,恒溫30min,冷卻至室溫后,用1:1的鹽酸調(diào)節(jié)pH至23,靜置分層,排出水相,再調(diào)pH至6,慢慢加入1/2固體氫氧化鈣,攪拌均勻,用離心機(jī)離心,上清液用萃取的方法,脫堿精制,濃縮即可得辣椒堿類化合物。陳來同等41人用丙酮浸提果皮,用堿溶液浸提辣椒籽,混合物經(jīng)溶劑蒸發(fā)后置于含20%甲苯的苯溶液中攪拌,然后于50%濃度的乙醇中萃取分層。含辣椒堿類化合物的溶液層經(jīng)結(jié)晶后可以得到純品,回收率為0.1%0.3%。此法中所用苯溶劑對人體傷害性較大。景作量42在文獻(xiàn)中報(bào)道,可從天然辣椒的肉體上采取細(xì)胞,將其包埋

40、固定,懸浮于5L含水的培養(yǎng)液中,32天后得到辣椒堿類化合物的含量達(dá)1.143×10-5g/L,如果培養(yǎng)時(shí)間長,含量會更大。將辣椒種子經(jīng)無菌處理,放入有濕潤濾紙的贊氏培養(yǎng)皿中,經(jīng)7天培養(yǎng)發(fā)芽,取1g芽細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng),辣椒堿類化合物的含量會增加很多。如在黑暗中培養(yǎng)含量會更大。另外,Iwai Kazuo43-46等人對辣椒堿類化合物在果實(shí)內(nèi)的合成部位、合成途徑與分布進(jìn)行了研究,試圖通過代謝調(diào)解或基因調(diào)控最大限度促進(jìn)辣椒堿類化合物的生物合成。1.5 辣椒堿類化合物的純化方法郭進(jìn)寶47以干辣椒為原料,用甲醇回流提取,所得浸膏以2%的鹽酸溶解。乙醚萃取除去辣紅素后,上樣離子交換柱,堿化后再以氯仿

41、洗脫,得到了較純的辣椒堿類化合物。張世文48以辣椒精為原料,將辣椒精溶于1%NaOH的溶液中,以2%的硫酸酸化,正己烷萃取并濃縮得辣椒堿類化合物粗品(純度82%84%。粗品辣椒堿類化合物溶于氫氧化鈉溶液中,經(jīng)離子交換法,以乙醇乙酸乙酯洗脫、濃縮、結(jié)晶得辣椒堿類化合物晶體,回收率為2.8%(相對于辣素。按GB1078 396標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn),辣椒堿類化合物的純度為98.5%。曾仕廉49用丙酮、石油醚、95%乙醇提取出辣椒油樹脂,再以乙醚作為結(jié)晶溶劑,得到粗辣椒堿類化合物的晶體,再經(jīng)硅膠柱層析純化后結(jié)晶,得到辣椒堿類化和物純品,純品的收率為0.23%(以干辣椒為基準(zhǔn),純度為91.3%。李緒文50等人以干辣

42、椒為原料,用丙酮浸提后,再用硅膠柱層析分離純化辣椒堿類化合物,結(jié)果回收率達(dá)0.038%(以干辣椒為基準(zhǔn),證明柱層析可以有效地進(jìn)行辣椒堿類化合物的提取與純化。高藍(lán)51等人也用硅膠柱層析的方法從含辣味物質(zhì)2.4%的黑紅色辣椒精中分離得到含辣味物質(zhì)22.2%的淡褐色辣椒精,從淡褐色辣椒精中分離得到辣味物質(zhì)的白色晶體。在眾多的文獻(xiàn)資料中,都可以見到用結(jié)晶法純化辣椒堿類化合物,如張世文,姚祖鳳4將粗品辣椒堿類化合物溶解于正己烷-乙酸乙酯混合溶劑中,重結(jié)晶得純度為92.5%的高純辣椒堿類化合物晶體,平均得率2.24%(相對于辣素。張彥雄37等人用超臨界CO2提取辣椒堿類化合物后就用結(jié)晶的方法純化辣椒堿類化

43、合物,得到的晶體純度可達(dá)96%。但是以上文獻(xiàn)均沒有詳細(xì)考查影響結(jié)晶產(chǎn)品回收率與純度的影響因素,本文將會簡單的考察結(jié)晶產(chǎn)品的影響因素。李浩明,高藍(lán)52兩人以S-8極性大孔吸附樹脂為吸附材料,95%乙醇和乙酸乙酯為解吸劑,得到的兩種解吸劑中辣椒堿類化合物的純度分別為31.6%、35.3 %,解吸率分別為95.6%、90.7%,樹脂的吸附容量為30mg/g。楊得坡53等人也于2004年申請了題名為大孔吸附樹脂法富集與純化辣椒堿的方法的專利。專利中辣椒堿類化合物提取液經(jīng)第一次上樣后可得到純度為33%的產(chǎn)品,重上樣及結(jié)晶后可以得到純度為97%以上的產(chǎn)品。除此之外,詳細(xì)報(bào)道大孔吸附樹脂純化辣椒堿類化合物的

44、文獻(xiàn)報(bào)道較少,為了更進(jìn)一步的研究大孔吸附樹脂對辣椒堿類化合物的純化效果,本論文主要選非極性大孔吸附樹脂法純化辣椒堿類化合物,所以下面將大孔吸附樹脂法重點(diǎn)介紹一下:大孔吸附樹脂為吸附型和篩選性原理相結(jié)合的分離材料。依靠它和被吸附的分子(吸附質(zhì)之間的范德華引力或氫鍵作用,通過它巨大的比表面將目標(biāo)產(chǎn)物從溶劑中吸附出來,然后根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的吸附力及分子量的大小,選擇一定溶劑將其從樹脂上洗脫下來從而達(dá)到分離、純化、除雜、濃縮等不同目的的一種分離方法。它的理化性質(zhì)穩(wěn)定,不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑,不受無機(jī)鹽及強(qiáng)離子低分子化合物的影響。與傳統(tǒng)吸附劑相比,它具有選擇性好、吸附容量大、洗脫容易、機(jī)械強(qiáng)度高、耐污染、流

45、體阻力小、可以多次反復(fù)使用、再生比較容易等優(yōu)點(diǎn)。常用來提取中草藥化學(xué)成分。吸附樹脂在應(yīng)用上的特點(diǎn)是介于活性炭、硅膠、硅藻土等吸附劑與離子交換吸附劑之間,既有類似于活性炭的吸附能力,又比離子交換劑更容易再生。大孔吸附樹脂在天然產(chǎn)物的純化方面取得了一定的成就。正因?yàn)榇罂孜綐渲闹T多優(yōu)點(diǎn),這項(xiàng)技術(shù)在二十世紀(jì)七十年代末就已逐漸應(yīng)用到天然產(chǎn)物的提取分離中54-55。例如,王瑞芳56通過對ME-1,ME-2,ME-3三種樹脂的篩選,確定出ME-3對喜樹堿和喜果苷有較大的吸附容量,分離得到的喜樹堿和喜果苷的含量分別達(dá)到15.08%和67.16%。Fu Yujie等人57利用大孔吸附樹脂從木豆提取物中制備分

46、離出牡荊素和異牡荊素,結(jié)果表明ADS-5型號樹脂能夠很好的分離純化產(chǎn)品,牡荊素和異牡荊素的純度分別從0.86%和1.53%提高到3.5%,17.63%,收率分別為65.03%和73.99%。Silva 58等人利用大孔吸附樹脂從印加豆的樹葉中分離提純出酚酸化合物,結(jié)果表明,XAD-7型的大孔吸附樹脂的吸附性能最好,每克樹脂能夠得到239毫克產(chǎn)品,而且產(chǎn)品在樹脂上的吸附性能能很好的符合Freundlich和Langmuir模型。隨著更多專業(yè)性樹脂的開發(fā),大孔吸附樹脂對天然產(chǎn)物的分離提純將越來越受到重視,成為分離純化的重要手段之一。1.6 辣椒堿單體的制備方法目前辣椒堿主要是從天然辣椒中提取得到,

47、但是一般提取得到的物質(zhì)是辣椒堿類化合物,而很難得到較高純度的辣椒堿單體。因而用化學(xué)合成的方法制得較純的辣椒堿單體就顯得很重要?，F(xiàn)在,Kaga59等人以三苯磷與6-溴乙酸為起始原料,經(jīng)四步反應(yīng),合成得到了辣椒堿單體,總收率為26.6%。至今,見利用反相高效液相色譜法制備純辣椒堿單體的研究只見到一篇文獻(xiàn)報(bào)道,即吳波60等人先從辣椒中分離純化辣椒堿類化合物,再用反相高效液制備色譜法制備辣椒堿單體,并用MS法確證分離物為單一的辣椒堿單體,從而說明反相型制備色譜法能夠從辣椒堿類化合物中分離制備出辣椒堿單體,而對于辣椒堿單體制備的產(chǎn)率,流動相消耗,回收率等重要的工藝參數(shù)沒有加以研究,所以本論文將在吳波的反

48、相高效液相色譜法制備純辣椒堿單體的研究基礎(chǔ)上,更進(jìn)一步研究辣椒堿單體制備的具體的工藝參數(shù),為辣椒堿單體的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考價(jià)值。1.6.2.1 高效液相制備色譜的概述色譜法61是1906年俄國植物學(xué)家MichaelTswett將含有有色的植物葉子色素和溶液通過裝填有白堊粒子吸附劑的柱子,企圖分離它們時(shí)而發(fā)現(xiàn)并命名的。而首次真正意義上的制備型液相色譜分離是20世紀(jì)30年代對植物代謝產(chǎn)物色素(如葉綠素及胡蘿卜素等的分離62。20世紀(jì)70年代初,高效液相色譜(HPLC問世。此后的30年,由于HPLC具有高的分辨率及分離純化鑒定一次性完成的特點(diǎn),使其在許多學(xué)科的研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。但是由于傳統(tǒng)的分

49、析型HPLC分離的樣品量少,使樣品的制備分離受到限制。為了克服這一缺點(diǎn),后來將分析型HPLC放大為制備型HPLC,使產(chǎn)品的分離量達(dá)到克數(shù)量級及以上。制備型高效液相色譜具有柱效高、分離迅速等特點(diǎn),是制備、純化難分離物質(zhì)的極好手段。也為純化物,標(biāo)準(zhǔn)品的制備提供了很好的方法,它與分析色譜的主要區(qū)別列在表1.1:表1.1 分析與制備HPLC:目的和特點(diǎn)的區(qū)別63Table 1.1 Analysis and preparative HPLC: the difference of purpose and characteristic63分析HPLC制備HPLC目的 目的樣品組成的信息 純品的回收通常研究大

50、部分或全部樣品組分 通常只對一種或幾種樣品組分感興趣特征 特征進(jìn)樣量僅夠檢測用即可 盡可能加大進(jìn)樣量以生產(chǎn)最多的純品分析HPLC制備HPLC柱內(nèi)徑15mm,柱填料5µm或更小 柱內(nèi)徑110cm(或更大,柱填料7µm或更大 HPLC泵最多提供10ml/min HPLC泵提供遠(yuǎn)大于10ml/min進(jìn)樣通常不是問題 進(jìn)樣較難,需多加注意為最大靈敏度選擇檢測條件 為降低的靈敏度檢測條件樣品在流動相中的溶解度通常不重要 樣品溶解度一般非常重要流動性揮發(fā)不重要 流動相應(yīng)該是揮發(fā)的,禁用不揮發(fā)的添加劑1.6.2.2 高效液相制備色譜的分類高效液相制備色譜根據(jù)鍵合固定相與流動相相對極性的強(qiáng)

51、弱,可分為正相液相色譜和反相液相色譜。在正相液相色譜法中,鍵合固定相的極性大于流動相的極性,它包括以硅膠和氧化鋁為固定相的吸附色譜,以及各種極性化合物的為固定相的分配色譜或極性鍵合相的色譜。適用于分離油溶性和水溶性的極性和強(qiáng)極性化合物。在反相液相色譜法中,鍵合固定相的極性小于流動相的極性,通常是以非極性的、不同鏈長的苯基鍵合相或烷基鍵合相為固定相,適用于分離非極性、極性或離子型化合物,其應(yīng)用范圍比正相鍵合相色譜法更廣泛,在整個(gè)高效液相色譜中約70%以上的分離工作是由反相液相色譜完成的。根據(jù)處理量不同分為半制備液相色譜和制備液相色譜。半制備色譜柱內(nèi)徑常為810mm,固定相粒徑約10µm

52、,用于分離1mg至100mg的混合物64,若混合物量太多,可以分批進(jìn)料。制備液相色譜固定相粒徑530µm,復(fù)雜的配套系統(tǒng)使效率大為增加。本論文將用到反相型半制備色譜。整個(gè)色譜系統(tǒng)是由泵、進(jìn)樣器、色譜柱、監(jiān)測器和工作站等核心部件組成。泵負(fù)責(zé)連續(xù)、高精度地輸送流動相,樣品由流動相攜帶在流動相和固定相之間進(jìn)行多次分配,最后離開色譜柱,進(jìn)入檢測器而產(chǎn)生效應(yīng),所得信號被工作站記錄并處理,從而得到有關(guān)樣品的定性定量的信息。流動相將用到水和與水混溶的有機(jī)溶劑,如甲醇、乙睛、異丙醇及四氫吠喃等。因?yàn)檫@些有機(jī)溶劑的特點(diǎn)是沸點(diǎn)適中、粘度小、化學(xué)穩(wěn)定性好、紫外本底吸收小,以及對樣品溶解性能好。調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑

53、和水的比例,可獲得較大范圍內(nèi)的溶劑強(qiáng)度,以適應(yīng)不同樣品極性的需要。1.6.2.3 高效液相制備色譜的應(yīng)用目前高效液相制備色譜已經(jīng)成為制備天然產(chǎn)物的一種重要的手段,它具有分離效果好,產(chǎn)量大,純度高,易于控制等優(yōu)點(diǎn),目前,高效液相制備色譜主要用于樣品的分離純化和標(biāo)準(zhǔn)品的制備65。1. 標(biāo)準(zhǔn)品的制備雷厲等66利用反相制備高效液相色譜結(jié)合溶劑萃取、大孔吸附樹脂柱色譜和葡聚糖凝膠LH220柱色譜方法,從管花肉蓯蓉的乙醇提取物中純化制備了苯乙醇苷類化合物松果菊苷的標(biāo)準(zhǔn)品,純度達(dá)到98%以上。方法操作簡便,重現(xiàn)性好,可用于松果菊苷及其他苯乙醇苷類化合物的大量制備。肖偉濤等67采用制備高效液相色譜技術(shù)分離純化

54、茶氨酸對照品,純度達(dá)到98%以上,制備收率大于60 %。方法簡便,生產(chǎn)周期短、費(fèi)用低,茶氨酸產(chǎn)品可用作分析方法的對照品。余麗娟68等將羅漢果鮮果的水提物以AB-8吸附樹脂分離、D-280離子交換樹脂脫色后,利用半制備高效液相色譜法得到三萜皂甙類化合物羅漢果甜甙標(biāo)準(zhǔn)品,純度達(dá)98.5%。色譜柱為Alltech Econosphere NH2柱,流動相為乙腈/水(68/32,v/v 溶液,流速5ml/min,檢測波長203 nm,柱溫40 。此方法具有操作簡便、重現(xiàn)性好、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)。2. 樣品的分離純化韓金玉69液相制備色譜分離純化三七葉甙中人參皂甙單體Rb3,其純度也達(dá)到了95%。陳曉輝等

55、71人利用制備反相高效液相色譜法從杉材中分離出兩種倍半萜類化合物,分別為( - -cubebol 和( + -2 ,7 (14,10-bisa-bolatrien-1-ol-4-one 。其純度分別為98.7%和99.1%。王超展70用半制備型反相高效液相色譜(RPLC對箭葉淫羊藿提取液中的5種主要黃酮類化合物進(jìn)行了分離制備,也取得了較好的分離效果。于放、張冬艷等71人利用制備高效液相色譜法從喜樹細(xì)胞中分離制備了在原植株內(nèi)不存在的兩種全新的生物堿單體:喜樹異堿A和喜樹異堿B在C18柱上,以乙腈/水(35/65,v/v為流動相,流速為5ml/min,采用等度洗脫方式,制備了這兩種化合物。經(jīng)紫外光

56、譜、紅外光譜及質(zhì)譜分析,對這兩種化合物進(jìn)行了確認(rèn)。高效液相色譜分析表明,制備的喜樹異堿A和喜樹異堿B的純度均在97%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)以上。在該色譜條件下,各色譜峰達(dá)到了基線分離,且分離時(shí)間短,溶劑用量少。彭金詠、范國榮等人72利用半制備型反相高效液相色譜對白花敗醬草氯仿萃取物進(jìn)行了分離制備。色譜柱為YWG C18(200mm× 10.0 mm id,10µm,流動相為乙腈/水/乙酸(55/45/1,v/v/v,檢測波長280nm,流速4.0ml/min,進(jìn)樣750µL,在此條件下分離制得了5個(gè)單體化合物。曹福祥等人73利用反相高效液相色譜法從灰花紋鵝膏菌中分離純化出-鵝

57、膏毒肽,產(chǎn)品純度達(dá)99%以上,回收率為96%。國外Adamson74用高效液相制備色譜分離出不同結(jié)構(gòu)的CPP。Seiichi sakuma75采用反相制備色譜從傘形科植物紅柴胡中分離出三種單體皂苷成分,其中單體皂苷收率大于90%,純度大于98%。Marcus Degerman76等人研究了從脫酰胺胰島素中分離胰島素的反相型高效液相制備色譜的模型,研究了回收率的變化對純度的影響,從而找到液相操作的最佳操作點(diǎn)。Wu Shihua 等人77用反相型高效液相制備色譜從蓽茇中分離酰胺,其色譜條件為:玻璃柱(500×10mm,填料為反相硅膠,結(jié)果有九種目標(biāo)酰胺物質(zhì)得到分離純化,純度達(dá)95%以上。1.6.2.4 色譜柱的裝填本論文將需要自己裝填制備色譜柱,所以下面