HPLC法測定腎炎舒片中人參皂苷Re的含量

1、HPLC法測定腎炎舒片中人參皂苷Re的含量                         【摘要】【關(guān)鍵詞】  腎炎舒片 人參皂苷Re含量 高效液相色譜法 腎炎舒片由人參等十味中藥材，經(jīng)加工提取制成。用于治療脾腎陽虛型腎炎引起的浮腫、腰痛、頭暈、乏力等癥。人參是方中的君藥，具有大補元氣、助精養(yǎng)神的作用，且又為細貴藥材。因此，我們采用高效

2、液相色譜法對人參中的人參皂苷Re進行含量測定，作為其制劑內(nèi)在質(zhì)量控制的指標，方法簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好。    1  儀器與試藥    1.1  儀器  高效液相色譜儀LC-10AT（日本島津）；檢測器：紫外；數(shù)據(jù)處理：SPD-10A；電子天平：METTLER AE240（瑞士）。    1.2  試藥  人參皂苷Re對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號：0754-9911，供含量測定用；乙腈為色譜純。腎炎舒片、人參原料均由吉林鹿王制藥有限公司提供。

3、    2  色譜條件    色譜柱：Aichrom Bond AQ C18 5m 4.6×250mm AI-04012822；柱溫：40；流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液（99：400）；流速：0.8ml/min；紙速：1mm/min；檢測波長：203nm1；靈敏度：AUFS0.04；理論塔板數(shù)不得低于2500。    3  對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液    3.1  對照品溶液的制備  精密稱取人參皂苷Re對照品

4、10mg，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Re0.4mg的溶液，即得。    3.2  供試品溶液的制備2  取裝量差異項下的本品，除去包衣，研細，取粉末4g，精密稱定，置索氏提取器中，加氯仿回流提取至提取液無色，棄去氯仿液，揮盡氯仿，加甲醇加熱回流提取至提取液無色，收集甲醇液，蒸干。殘渣用正丁醇飽和的水30ml使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取4次（20、20、20、15ml），合并正丁醇液，用3倍量氨試液振搖洗滌3次，棄去氨試液，合并正丁醇液，蒸干，殘渣用水25ml溶解，裝入D101漏斗中，用水飽和的正丁醇提取4次（20、20、20

5、、15ml），合并正丁醇液，用3倍量氨試大孔吸附樹脂柱（濕法裝柱，內(nèi)徑1.5cm，長17cm，用水洗至無醇味，備用）上。先用水100ml洗脫，棄去洗脫液，繼用20%乙醇100ml洗脫，棄去洗脫液，再用70%乙醇100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇定量轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，即得。    3.3  人參陰性對照溶液的制備  取除去人參，其他成分按處方比例加入，照“腎炎舒片”制備方法制成陰性對照品，按“供試品溶液的制備”方法制成人參陰性對照溶液。    4  檢測波長的確定   

6、; 參照中國藥典2005年版一部人參【含量測定】項下，選用203nm為其檢測波長。    5  系統(tǒng)適用性試驗的考察    依上述方法，由儀器給出的理論板數(shù)n=7318。該色譜條件下，樣品可得到很好的分離，參照藥典及實驗，規(guī)定理論板數(shù)按人參皂苷Re峰計不低于2500。    6  流動相的選擇    參照中國藥典2005年版一部人參【含量測定】項下的流動相的比例，以人參皂苷Re色譜峰的保留時間及分離度為判定指標，經(jīng)反復(fù)試驗證實：乙腈-0.05%磷酸溶液（9

7、9:400）適合本法且分離效果較好，故定為本法的流動相。                                 7  提取方法的選擇    曾參照中國藥典2005年版一部人參【含量測定】項下的提取方法處理樣品，上機后雜質(zhì)峰多；后經(jīng)反復(fù)實驗采

8、用本方法，雜質(zhì)峰較少，分離度較好，利于含量測定。且經(jīng)薄層結(jié)果顯示，提取較徹底，故提取方法如前述。    8  陰性對照溶液的測定    為進一步考察實驗設(shè)計及測定方法的可行性，吸取本液20l注入液相色譜儀，按上述方法測定，結(jié)果表明人參陰性對照色譜圖在人參皂苷Re相應(yīng)的保留時間附近無干擾峰，證明本方法可行。    9  穩(wěn)定性試驗    分別精密吸人參皂苷Re對照品溶液，常溫放置，每間隔一定時間以相同體積20l（定量環(huán)）注入液相色譜儀中，依法測定，以人參皂苷

9、Re峰面積為指標，測定其穩(wěn)定性，結(jié)果見表1。表1     人參皂苷Re穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明：在48小時內(nèi)，人參皂苷Re在常溫條件下均基本穩(wěn)定。    10  標準曲線制備    精密吸取配制成不同濃度的人參皂苷Re（0.10、0.20、0.40、0.60、0.80mg/ml）的對照品溶液20l（定量環(huán)），注入高效液相色譜儀中，測定。以各自的濃度（mg/ml）為橫坐標、峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果見表2。表2    Re的標準曲線計算得回歸方程：Y

10、=17766834.51232952.30x  r=0.9999，由此確定人參皂苷Re的線性范圍在2.016.0g。    11  精密度試驗    取相同濃度的人參皂苷Re，5次進相同的體積，變異系數(shù)均符合規(guī)定，表明儀器精密度良好，見表3。表3  Re的精密度試驗結(jié)果    12  重現(xiàn)性試驗    取同一批樣品依法獨立測定5次，RSD=1.9%，表明重現(xiàn)性良好，見表4。表4  重現(xiàn)性試驗   

11、 13  供試品的測定    取上述“供試品溶液的制備”項下制備的溶液作為供試品溶液，備用。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20l，注入高效液相色譜儀，依法測定，即得。所測得人參皂苷總含量見表5。表5    腎炎舒片含量測定結(jié)果    14  最低限量的確定    如上表所示，6批樣品的平均含量為0.13mg/片，考慮到原料藥材本身含量變化及生產(chǎn)中的波動，仍取其含量平均值的80%為限度，暫定本品每片含人參皂苷Re（C48H82O18）不得少于0.10m

12、g    15  回收率測定    采用加樣回收測定法，按前文所述含量測定方法制備供試品溶液，進行HPLC法測定，結(jié)果見表6。表6      人參皂苷Re回收率測定結(jié)果表明：本法平均回收率人參皂苷Re 97.34%，RSD 1.5%，表明本法準確度較好，方法可行。    16  討論    影響實驗結(jié)果的因素：在除去包衣時，注意既盡量要刮去包衣，又不能刮去藥片本身。在樣品前處理中，要揮盡氯仿后再加甲醇，以免影響溶劑極性，影響雜質(zhì)的除去。樣品前處理中，D101大孔樹脂裝柱應(yīng)均勻，洗脫時，流速不宜過快，應(yīng)控制為1.5ml/min。D101大孔樹脂上樣前